目的:低氧会改变许多药物的口服生物利用度,其中也包括多种P糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)的底物(药物),提示低氧可能影响肠上皮细胞P-gp的功能.Caco-2细胞单层膜模型是当前研究肠上皮P-gp功能的经典模型.本研究通过结合Caco-2细胞单层膜模型与低氧处理,研究低氧对Caco-2细胞P-gp表达和功能的影响,有助于阐明高原低氧环境改变肠上皮药物转运的机制.方法:正常培养的Caco-2细胞在1％的O2浓度条件下分别培养24、48、72 h,提取膜蛋白后,采用蛋白质印迹法检测P-gp的表达水平,选择表达变化最显著的缺氧时间用于后续研究.于transwell小室中培养Caco-2细胞21 d,建立Caco-2细胞单层膜模型后,将其分为常氧对照组与低氧组,常氧对照组以正常条件继续培养72 h,低氧组在1％的O2 浓度条件下继续培养72 h,通过跨膜电阻(transepithelial electrical resistance,TEER)、荧光黄表观渗透系数(apparent permeability coefficient,Papp)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)活性及透射电镜下观察微绒毛与紧密连接结构,评价Caco-2细胞单层膜的完整性和极化状态.采用双向转运实验检测P-gp特异性底物罗丹明123(rhodamine 123,Rh123)的Papp,计算外排率.将Caco-2细胞在塑料培养瓶中连续培养21 d形成Caco-2细胞单层膜,在1％O2浓度条件下处理72 h后,采用蛋白质印迹法检测膜蛋白中P-gp的表达水平.结果:1％的O2浓度处理下调Caco-2细胞P-gp的表达,其中处理72 h下调最为显著(P<0.01);低氧组Caco-2细胞单层膜TEER大于400 Ω·cm2,荧光黄Papp小于5×10−7 cm/s,肠腔侧与基底侧AKP活性比值大于3.表明Caco-2细胞单层膜模型建立成功,且低氧处理未影响模型的完整性与极化状态.与常氧对照组相比,低氧组Caco-2细胞单层膜Rh123的外排率显著降低(P<0.01);1％的O2浓度培养72 h,下调Caco-2细胞单层膜P-gp的表达(P<0.01).结论:低氧抑制Caco-2细胞P-gp功能,其可能与P-gp表达水平降低有关.
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