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HBV 1.3倍基因组HepG2稳转细胞模型优势单克隆株的筛选及鉴定

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背景:乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)体外感染模型是开展HBV生命周期、致病机理、药物筛选等研究的基础。随着临床抗HBV治疗进入"功能性治愈""完全治愈"新时代的趋势，对能稳定模拟共价闭合环状DNA分子(covalently closed circular DNA，cccDNA)转录机制，乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein，HBx)致病机理的细胞模型的需求日益迫切。HBV1。3倍(1。3-fold HBV)全基因组包含了全部HBV生物信息，能依赖自身启动子启动转录过程，支持cccDNA形成和完整病毒复制，最接近于HBV体内感染状态下的生命周期。慢病毒转染是一种以慢病毒为载体，将外源分子如DNA，RNA等导入真核细胞的技术，可形成稳定转染。目的:采用慢病毒转染技术构建HBVl。3倍基因组HepG2稳转细胞模型，筛选并鉴定出能稳定、高效表达HBV生物标志物的优势单克隆株。方法:构建含1。3-fold HBV基因组信息的慢病毒质粒并包装慢病毒;以最佳感染复数(MOI)值将1。3-fold HBV慢病毒液侵染靶细胞HepG2，以抗生素杀稻瘟菌素(blasticidin，BSD)最佳筛选剂量筛选出稳定整合1。3-fold HBV基因的HepG2细胞系(1。3-fold HBV-HepG2)，继而采用PCR法鉴定该细胞模型中的HBV DNA序列。将1。3-fold HBV-HepG2稳转细胞进行培养并挑选出9株候选阳性单克隆，通过测序各单克隆细胞的侧翼序列，以确定9株候选阳性单克隆相应的基因组在HepG2细胞基因组中的插入位置，再根据各候选单克隆株表达HBsAg、 HBeAg的水平，筛选出最优势单克隆株。将该优势单克隆株与HepG2。2。15细胞株分别持续培养20代，比较这两种细胞株表达HBsAg、HBeAg、HBx、cccDNA、HBV DNA等标志物的水平及稳定性。结果:(1)将慢病毒pLenti-BSD-1。3-fold HBV以MOI=30的参数侵染HepG2细胞，72 h后加入BSD抗生素(终浓度1 μg/mL)进行筛选，连续培养15-20 d后，获得1。3-fold HBV-HepG2稳转细胞系，PCR鉴定出HBV DNA序列;(2)在挑选出的9株候选阳性单克隆中，编号A14的细胞株(命名为HepGA14)的HBsAg、 HBeAg表达水平最高，分别为24。28 IU/mL、39。62 NCU/mL，其插入HepG2基因组位置为1:166461695-166461715，确定为优势单克隆株;(3)与HepG2。2。15细胞株比较，HepGA14优势单克隆株1-20代能稳定、高表达HBsAg、 HBeAg、HBx、HBV DNA、cccDNA，差异均具有统计学意义(P＜0。05)。结论:成功构建并筛选出1。3-fold HBV基因组HepG2稳转细胞模型优势单克隆株HepGA14，这为后续开展HBV-宿主关系、发病机制及药物筛选等奠定良好的基础。
Screening and identification of dominant monoclonal HepG2 cell strain with 1.3-fold HBV genome

邱华、林栋毅、李锦源

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广西医科大学附属肿瘤医院 广西壮族自治区南宁市530021

乙型肝炎病毒 1.3倍基因组 稳转 细胞模型 优势单克隆

81860889816608272019M6533122020GXNSFAA297113桂卫科教发[2018]22号2017AB45166

2021

10.11569/wcjd.v29.i16.934

世界华人消化杂志
太原消化病研治中心

世界华人消化杂志

影响因子：1.023
ISSN：1009-3079
年,卷(期)：2021.29(16)
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