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慢病毒载体介导稳定表达Cas9基因的293T细胞系构建及其基因编辑效率验证

Construction of 293T cell lines with stably expressing Cas9 gene by lentiviral vector and identification of gene editing efficiency

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为通过慢病毒感染细胞构建稳定表达CRISPR/Cas9的293T细胞系,实现高效率基因编辑,PCR扩增Cas9基因片段,酶切后克隆到慢病毒载体pLent-EFla-MF-CMV-GFP-P2A-Puro上,将该质粒与慢病毒包装质粒psPAX2、pMD2.G共感染293FT细胞,48 h后收集病毒并浓缩纯化测定其病毒滴度,最后用纯化后的病毒感染293T细胞,通过抗性和荧光标记筛选得到稳定表达Cas9的细胞系,并对单克隆细胞进行DNA、RNA特异性和反转录验证.针对ABCG4基因设计sgRNA并构建重组载体感染单克隆细胞,通过DNA特异性和T7E1酶切验证基因敲除效率.结果 表明:成功构建了Cas9-pLent慢病毒载体,用构建成功的慢病毒载体对293FT细胞进行慢病毒包装(三质粒系统)并对包装成功的病毒进行了浓缩与纯化,最后通过病毒感染293T细胞,采用荧光观察的方式测定其病毒滴度均在106 TU·mL-1之上.用纯化后的病毒感染293T细胞并通过加药(Puro)进行抗性筛选,筛选出3株能稳定表达Cas9的293T细胞系,目的基因ABCG4的基因编辑功能验证表明其中1株T7E1酶切掉带明显,sgRNA靶向敲除效率较高,该株命名为Cas9-293T-10A.该研究建立了稳定表达Cas9的293T细胞系,可用于目的基因的高效敲除.

覃鸿妮、谢钰珍、杨晨晨、张勇

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金唯智生物科技有限公司,江苏苏州215123

CRISPR/Cas9 慢病毒载体 细胞系 基因编辑

江苏高校自然科学研究面上项目江苏省高职院校教师专业带头人高端研修项目

18KJD1800052019GRFX093

2020

10.16872/j.cnki.1671-4652.2020.04.005

扬州大学学报(农业与生命科学版)
扬州大学

扬州大学学报(农业与生命科学版)

CSTPCD北大核心
影响因子：0.924
ISSN：1671-4652
年,卷(期)：2020.41(4)
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