摘要
目的 旨在建立基于实时荧光多酶恒温扩增(exo-MIRA)技术的小鼠细小病毒(MVM)核酸检测新方法.方法 收集2021年1月至2022年1月南京大学医学院附属金陵医院实验动物室共75份小鼠肠道内容物标本.针对MVM VP2基因的保守区域设计4对引物,琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物以筛选最优引物对,并设计特异性荧光探针,构建exo-MIRA 检测法.通过检测梯度稀释模拟样本,进行检出限评价.检测其他小鼠病毒,包括仙台病毒(SV)、小鼠肝炎病毒(MHV)、小鼠鼠痘病毒(Ect)、小鼠肺炎病毒(PVM)、呼肠孤病毒(Reo),分析exo-MIRA法的交叉反应性.采用qPCR法和exo-MIRA法同时检测收集的75份标本,统计分析两种方法的一致性.以qPCR法为参比方法,评估该法的敏感度和特异度,进行诊断效能评价.结果 采用exo-MIRA技术建立MVM核酸检测方法,该方法检测MVM的检出限为10 copies/μL,且与其他五种小鼠病毒无交叉反应,可特异性检出MVM.75份标本检出结果显示,exo-MIRA法和qPCR法高度一致,Kappa值为0.921(P＜0.05),exo-MIRA法的敏感度为100.0％,特异度为96.7％.结论 建立了一种基于实时荧光MIRA恒温扩增技术的MVM核酸检测方法,具有简单快速、实验要求低、敏感特异等优点.该方法可应用于现场复杂环境的即时检测,在实验动物质量检测应用上有一定前景.
基金项目
军队实验动物专项科研课题(SYDW[2020]-17)
中国博士后科学基金新冠肺炎疫情防控专项(2020M670092ZX)
江苏省卫生健康委科研项目(M2020029)
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