摘要
本文旨在对来源于Thermoprotei archaeon菌株的D-LI(最适pH6.5)进行弱酸特性改造,以期该酶在pH5.5条件下生产D-甘露糖,从而抑制原有的美拉德反应,减少分离成本.基于蛋白序列比对及酸碱氨基酸置换策略,首先设计了8个单点突变,而后从中选择3个优良单点突变体E82K、P105K、E165K进一步进行两两组合双点突变.结果表明双点突变体E82K/P105K较野生酶的最适pH由6.5迁移至6.0,且在pH5.5条件下的酶活是原始酶的3.4倍.该突变体在以D-果糖和D-甘露糖为底物时的动力学参数Km值分别为78.77 mmol/L和328.12 mmol/L,kcat/Km值分别为15.37 mmol/L-1·min-1和48.92 mmol/L-1·min-1.以80 g/L的D-果糖为底物反应10 h后,双点突变体E82K/P105K在pH5.5反应时的转化率较接近于原始酶在pH6.5时的转化率,美拉德反应程度较原始酶降低了约3～4倍,为工业上利用D-LI生产D-甘露糖提供了可行的酶制剂.
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