摘要
目的:利用重组毕赤酵母高效表达抑菌活性较好的牡蛎抗菌肽Molluscidin.方法:按照毕赤酵母密码子偏好性优化合成牡蛎抗菌肽Molluscidin,利用生物信息学方法分析其基本理化性质,经EcoRⅠ和NotⅠ双酶切后与表达载体pPICZαA连接,构建重组质粒pPICZαA-CgMoCo,电转至毕赤酵母X-33,利用博来霉素抗性和PCR筛选阳性转化子,利用甲醇诱导表达并结合SDS-PAGE和Western blot分析验证,通过甲醇浓度和培养时间优化诱导表达条件,利用滤纸片琼脂扩散法测定培养上清的抑菌活性.结果:获得优化核酸序列,生物信息学分析显示Molluscidin的预期分子量为6521.87 Da,等电点为11.28,在酵母体内半衰期>20 h,理化性质较为稳定;成功构建重组质粒pPICZαA-CgMoCo,目的基因成功嵌入毕赤酵母,SDS-PAGE和Western blot验证获得1株高效表达的重组酵母,其优化表达条件为30℃、250 r/min、1.0％甲醇诱导表达48～72 h,滤纸片琼脂扩散法初步证明重组Molluscidin对大肠杆菌、肺炎克雷伯菌等革兰氏阴性菌和金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌等革兰氏阳性菌均具有较好的抑菌活性.结论:筛选到1株重组毕赤酵母X-33/pPICZαA-CgMoCo,能高效表达抑菌活性较好的重组牡蛎抗菌肽Molluscidin,为其生产应用奠定了基础,也为重组贝类来源抗菌肽的开发利用提供了可资参考的技术途径.
基金项目
福建省卫生健康中青年骨干人才培养项目(2019-ZQNB-21)
福建省中青年教师教育科研项目(JAT190849)
海洋生物医药资源福建省高等学校工程研究中心(厦门医学院)开放课题(XMMC-MBS201901)
天然化妆品福建省高等学校工程研究中心(厦门医学院)开放课题(XMMC-NC201901)
厦门医学院大学生创新创业训练计划(201912631029)
厦门医学院大学生创新创业训练计划(202012631041)
厦门医学院大学生创新创业训练计划(202112631012)
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