摘要
目的:构建非选择性阳离子通道蛋白TRPV4的原核表达纯化系统,并对其进行生物信息学分析,为与该目标蛋白相关疾病的研究和药物活性成分筛选提供技术支持.方法:将人源TRPV4基因分别克隆至pET-28a(+)、pET-32a、pET-15b、pGEX-5X-1、pEX-4T和pGEX-6p-1等6种表达载体,并利用BL21和Rossetta两种大肠杆菌表达宿主构建TRPV4原核表达系统.采用谷胱甘肽亲和层析和镍柱亲和层析法分离纯化目标蛋白.通过生物信息学技术对目标蛋白进行分析,获得其相应的理化性质和结构参数.结果:利用pGEX-6p-1载体和Rossetta构建了GST-TRPV4和GST-TRPV4-6his融合蛋白原核表达系统.诱导表达目标蛋白的IPTG浓度为0.6 mmol/L时,GST-TRPV4融合蛋白有明显表达,IPTG浓度为0.4 mmol/L时,GST-TRPV4-6his融合蛋白有明显表达,表达温度均为18℃.纯化GST-TRPV4-6his融合蛋白时,咪唑溶液在100 mmol/L或200 mmol/L时可以得到完整的GST-TRPV4-6his融合蛋白.结论:本文首次在原核表达系统中成功构建和表达纯化了人源TRPV4离子通道蛋白,并利用生物信息学分析解析了该蛋白的理化性质,为后续高纯度大量表达和进一步研究奠定了良好的基础.
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