摘要
目的:以Rhodococcus erythropolis CCM2595来源的腈水合酶为研究对象,利用半理性设计以及定点突变以获取其对烟腈底物亲和力更高的突变体.方法:通过序列比对找到同源性很高的1AHJ蛋白并采用Swiss-Model和iTASSER等软件进行评估.利用Discovery Studio 2016(DS)将1AHJ与烟腈进行分子对接并进行虚拟氨基酸突变,预测并筛选出亲和力明显提升的氨基酸突变位点.构建突变重组质粒转化至大肠杆菌表达感受态中进行异源表达,并通过高效液相色谱检测分析对烟腈的生物转化情况.结果:通过虚拟氨基酸突变,得到腈水合酶α亚基CYS113突变为TYR(C113Y)、CYS115突变为ASN(C115N)、β亚基VAL52突变为ARG(V52R)后的三位点突变体,酶纯化后通过酶促反应常数分析发现,与野生型相比突变体Km值由突变前的16.78 mmol/L降低为12.69 mmol/L,酶活由12.14 U/mL提高到15.15 U/mL.结论:通过虚拟氨基酸突变得到的腈水合酶三突变体ReNHase C113Y/C115N/V52R对烟腈的底物亲和力提高了24.37％,酶活提高了24.79％,以上结果为烟腈工业化应用的提高提供了新的理论依据.
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