摘要
嗜热酸性III型普鲁兰水解酶TK-PUL在液化条件下可完全水解淀粉为淀粉糖,在"液化糖化一步法"的淀粉制糖工艺中具有巨大的应用潜力.本研究拟采用易错聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术提高TK-PUL的催化活性.经过两轮易错PCR及高通量筛选,获得了催化活性提高的突变体L538D.与TK-PUL相比,L538D以可溶性淀粉为底物的比酶活力提高了50％,以普鲁兰多糖为底物的比酶活力提高了21％;L538D以可溶性淀粉、普鲁兰多糖为底物的kcat/Km值分别提高了44％、27％.即L538D的α-1,4-糖苷键水解活性和α-1,6-糖苷键水解活性均明显提高,并且其α-1,4-糖苷键水解活性的提高幅度更大.同源模建得到的蛋白质分子结构显示,将TK-PUL中Leu538替换为Asp,可能通过缩短氨基酸残基侧链的长度和减弱氨基酸残基的疏水性,提高了催化活性位点Glu538所在loop结构的柔性,从而提高酶的催化活性.本研究结果表明,TK-PUL中Leu538是影响其催化活性的重要氨基酸残基.
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