摘要
目的:本研究旨在实现硫酸软骨素裂解酶ABC Ⅱ(chondroitinase ABC Ⅱ,ChSase ABC Ⅱ)的高效可溶性表达并研究其酶学性质,为ChSase ABC Ⅱ在药品和保健食品生产中的应用奠定基础.方法:在优化ChSase ABC Ⅱ基因原始序列的基础上,构建重组质粒pET-28a-His-ChSase ABC Ⅱ并优化其表达条件;利用亲和层析得到带有多聚组氛酸标签(polyhistidine-tag,His-tag)的ChSase ABC Ⅱ融合蛋白后,研究了 His-ChSase ABC Ⅱ的部分酶学性质.结果:构建的His-ChSase ABC Ⅱ融合蛋白表达系统能在大肠杆菌中实现可溶性表达;在表达宿主为E.coliBL21(DE3)和诱导剂(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)浓度为125 μmol/L的优化条件下,发酵液酶活力可达到7206.83±184.27 IU/L;纯化后的His-ChSase ABC Ⅱ酶比活力为22.02±0.39 IU/mg蛋白,最适pH和温度分别为7.5和40℃,其在30～40℃条件下较为稳定,且半衰期在2h以上.His-ChSase ABC Ⅱ能特异性有效分解硫酸软骨素,其Km值为10.4±0.8 μmol/L,Kcat值为9.4±0.2 s-1.结论:本论文通过基因优化和融合表达等策略实现了His-ChSase ABC Ⅱ的高效表达和纯化.此外,His-ChSase ABC Ⅱ的酶学性质可基本满足其在医药和营养产品工业生产中的应用需求.
基金项目
北京市优秀人才培养项目(拔尖自然科学)(2020Z002-002-KWT)
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