摘要
目的:对菌株Bacillus sp.B110的胞内麦芽糖淀粉酶BMAL进行基因克隆、异源表达、纯化及酶学性质研究,为后期开发新的淀粉加工用酶打下基础.方法:使用PCR技术对Bacillus sp.B110的胞内麦芽糖淀粉酶bmal基因序列进行全长克隆,异源表达,使用Ni2+-NTA进行纯化,再对其酶学特性进行测定,使用序列分析工具BioEdit、MEGA等对其氨基酸序列进行分析,使用AlphaFold2对其三级结构进行预测分析.结果:BMAL基因全长1770 bp,编码一个589氨基酸残基的蛋白.重组酶rBMAL经Ni2+-NTA亲和层析纯化后,SDS-PAGE电泳结果显示其分子量大小为63 kDa.氨基酸序列分析和三维建模表明BMAL与来源于B.subtilis 168和B.subtilis SUH4-2的麦芽糖淀粉酶有较高的一致性,且BMAL具有一个麦芽糖淀粉酶所独有的N端结构域以及由Asp328-Glu357-Asp424三个氨基酸残基所构成的催化中心.重组酶rBMAL最适反应温度为45℃,最适反应pH为6.0.重组酶rBMAL在30℃条件下保藏7 h残留酶活为60％,但在60℃条件下保藏2 h残留酶活力下降98％,说明BMAL对热敏感.重组酶rBMAL在4℃,pH7.0～9.5保藏12 h活性稳定.当存在1 mmol/L的金属离子Mg2+时,重组酶rBMAL活力提高36％,而Ni2+、Fe3+、Co2+、Cu2+、Zn2+、Al3+、Ca2+对重组酶rBMAL有抑制作用,酶活力减少85％～48％.有机溶剂和化学试剂甲醇、乙醇、丙酮、异腈、EDTA和SDS对重组酶rBMAL有较强的抑制作用,酶活力减少至32.3％～64.8％.底物特异性实验结果证实BMAL最适底物为环精糊.结论:Bacillus sp.B110的胞内麦芽糖淀粉酶BMAL具有良好的催化特性和pH稳定性,在面包烘焙工业上具有潜在的应用价值.
基金项目
国家自然科学基金(31560031)
江西省教育厅科学技术研究项目(GJJ160387)
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