前期通过分泌蛋白质谱分析和转录组测序,确定了一株高产漆酶的白腐菌为灵芝,其分泌漆酶的编码基因为 lcc1.本研究 PCR扩增 lcc1基因的基因组序列(lcc1-D)和 cDNA序列(lcc1-C),分别构建表达载体(pSZH6R-lcc1-D、pSZH6R-lcc1-C).通过农杆菌介导法转化黑曲霉TH-2,筛选出在糖化酶基因glaA位点发生同源重组的纯合黑曲霉转化子.摇瓶发酵后取发酵液上清进行Native-PAGE检测和酶活测定,结果表明,重组菌株lcc1-C的漆酶表达量和酶活力高于lcc1-D,酶活力最高值分别为 431.94 U/L和 218.06 U/L.Real-time PCR结果表明,lcc1-C中的漆酶mRNA水平是lcc1-D的 3.38倍.对重组漆酶进行酶学性质分析,发现其最适反应温度为60℃、最适pH为 3.5.在染料脱色实验中发现重组漆酶对孔雀石绿、中性红、甲基橙具有明显脱色作用,介体存在时能增强漆酶对染料的脱色效果,对中性红脱色效率最强,48 h脱色率可达到 91.21%.为改善重组漆酶的折叠,向重组菌株lcc1-C的发酵培养基中添加渗透调节剂,结果显示,在添加 0.4 mol/L TMAO时酶活力达到1301.67 U/L,提高了1.97倍;在添加0.5 mol/L脯氨酸时酶活力达到2037.22 U/L,提高了3.64倍;在添加0.5 mol/L甘氨酸时酶活力达到1434.03 U/L,酶活力提高了2.27倍.
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