摘要
为了探究重组菌株 pET-28a(+)-cgt-T1/BL21(DE3)产生的环糊精葡萄糖基转移酶(Cyclodextrin glucosyltransferase,CGTase)催化合成 2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸(Ascorbic acid 2-glucoside,AA-2G)的效果,用LB发酵培养基表达重组蛋白CGTase-T1,经亲和纯化柱纯化并浓缩后,测定其β-环化活性和歧化活性.以维生素C(Vitamin C,VC)和β-环糊精为底物,酶法合成AA-2G,并通过单因素优化实验,进一步探究了不同糖基供体、底物浓度、pH、温度、底物比例、蛋白浓度以及反应时间对AA-2G产量的影响,对酶合成AA-2G的动力学进行了分析.结果表明:此酶具有合成AA-2G的能力,未优化前AA-2G的产量为 0.67 g/L.优化后,考虑到低成本和经济效益,选择可溶性淀粉和麦芽糊精为糖基供体,当糖基供体为可溶性淀粉时,底物浓度为70 g/L,反应pH4.5,反应温度 37℃,底物比例 3/3(VC/糖基供体),蛋白浓度 5.0 mg/mL,反应时间为 42 h时,该重组CGTase催化合成AA-2G的产量最高能达到 12.68 g/L;当糖基供体为麦芽糊精时,底物浓度为 30 g/L,反应pH5.0,反应温度37℃,底物比例4/2,蛋白浓度5.0 mg/mL,反应时间为30 h时,该重组CGTase催化合成AA-2G的产量最高能达到 4.96 g/L.在最适条件下,AA-2G的产量分别是未优化反应条件下的 18.93倍和 7.40倍.经动力学分析发现可溶性淀粉作为糖基供体的催化效率高于麦芽糊精,因此,可溶性淀粉作为糖基供体比麦芽糊精更具有优势,合成得到AA-2G的产量更高.本研究成功将重组CGTase-T1用于AA-2G的合成,通过优化酶法合成的反应条件,使AA-2G的产量得到了大幅提高,为实现AA-2G的工业生产提供参考意义.
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