摘要
目的:建立一种快速、高效、可视化的细菌多黏菌素耐药基因mcr-1检测方法,为其基层检测的展开提供依据和便利.方法:利用重组酶聚合酶扩增结合胶体金侧向流试纸条技术(Recombinase polymerase amplification combined with a lateral flow dipstick,RPA-LFD),辅以手持式胶体金读数仪;根据mcr-1基因保守序列设计合成一对特异性RPA引物,通过对反应条件和体系的优化,以及特异性试验、灵敏度试验、模拟食样试验和实际样品试验,成功建立了可视化定量检测细菌多黏菌素耐药基因mcr-1的RPA-LFD方法.结果:在引物浓度400 nmol/L,引物比例 1∶1 时,该方法最佳反应条件为Mg2+浓度 14.0 mmol/L,反应温度 37℃,反应时间 20 min;灵敏度好,标准曲线方程为y=0.117x+0.051,定量限为 101～108 copies/μL,检出限为 101 copies/μL,比PCR法低一个数量级且模拟样品检出结果与PCR法一致.利用建立的RPA-LFD法对猪肉样品、鸡肉样品、生猪养殖场环境样品、肉鸡养殖场环境样品、大肠杆菌分离株和弯曲肠杆菌分离株各 15份中多黏菌素耐药基因mcr-1携带情况进行分析;RPA-LFD法与常规PCR法阳性样本检出率一致,共检出 9份mcr-1基因阳性样品.RPA-LFD定量分析显示,阳性样品中mcr-1基因浓度在 4.5×102～8.6×104 copies/μL之间.结论:本研究建立的细菌多黏菌素耐药基因 mcr-1的RPA-LFD检测法特异性强、灵敏性高、操作简单,可广泛应用于基层检验.
基金项目
国家自然科学基金(31901792)
国家自然科学基金(31801655)
浙江省基础公益研究计划(LGN22C200013)
宁波市公益类科技计划(2022S014)
萧山区重大科技计划(2021226)
浙江省大学生科技创新活动计划暨新苗人才计划(2022R409A050)
浙江省大学生科技创新活动计划暨新苗人才计划(2022R409A057)
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