摘要
目的:筛选并优化限制性内切酶Bsa I的三维结构样品制备的方法.方法:本课题采用大肠杆菌表达系统表达Bsa I蛋白及其硒代衍生物.首先构建重组表达载体pBAD-Bsa I,转化到大肠杆菌(E.coli)ER2566中进行表达,并采用亲和层析和阴离子交换层析进行纯化.然后利用质谱、圆二色谱的方法测试硒代蛋白衍生情况,并对其进行酶活测定.最后采用坐滴法进行初步的晶体生长研究.结果:通过两步纯化方法获得了纯度大于 90%的重组Bsa I和Se-Bsa I硒代蛋白;经质谱检测发现重组Se-Bsa I蛋白中的 11个甲硫氨酸全部硒代,圆二色谱检测和酶活测试确定了硒代对Bsa I蛋白的结构和活性无明显影响.结晶实验显示重组Bsa I蛋白不仅可以在 0.2 mol/L酸镁四水合物、pH6.5的 0.1 mol/L二甲胂酸钠三水合物、20%聚乙二醇 8000的条件下生长出颗粒状结晶,而且可以在pH4.6的 0.1 mol/L三水醋酸钠、2 mol/L硫酸铵的条件下生长出球状结构晶体.结论:本研究成功实现了BsaI蛋白及其硒代蛋白的重组表达,并对蛋白晶体条件进行初筛,旨为解析BsaI蛋白三维结构提供一定的参考.
基金项目
江苏省高等学校自然科学研究项目(22KJB180012)
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