摘要
针对目前国产食品级亮氨酸氨肽酶的工业生产产量不高的现状,将米曲霉、黑曲霉和酱油曲霉的5 个亮氨酸氨肽酶基因(lapA、laplO、lap2、laplS、laplN)在低蛋白背景的无孢黑曲霉HL-1中进行重组表达,通过信号肽替换对其编码区进行改造,利用杂合启动子PnaⅡ及营养缺陷标记pyrG构建表达载体,并基于规律间隔成簇短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)/Cas9工具设计亮氨酸氨肽酶的基因组定点整合策略,获得高活力的亮氨酸氨肽酶表达菌株,重组菌株LapA-C的亮氨酸氨肽酶活力达到11701.2U/mL,比未利用CRISPR工具的LapA-T重组表达菌株的酶活力(2476.0U/mL)提高了约3.7倍.此外,通过融合6XHis标签实现了重组亮氨酸氨肽酶LapA的纯化,并对其进行了酶学性质研究:蛋白质大小约为35.0kDa,重组亮氨酸氨肽酶LapA最适pH值为8.5,最适温度为65℃.综上所述,本研究基于CRISPR策略成功实现了亮氨酸氨肽酶在黑曲霉中的高效重组表达.
基金项目
国家自然科学基金面上项目(31871736)
广东省重点领域研发计划项目(2018B020205002)
广东省自然科学基金(2019A1515010065)
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