摘要
旨在获得猪CCA R1基因的完整CDS序列,研究其亚细胞定位和表达特性,探究其对细胞增殖的影响和作用机制.本研究以1日龄马身猪肾组织cDNA为模板,采用RT-PCR技术分段扩增猪CCA R1基因的CDS区,通过测序和序列拼接获得完整CDS区;采用细胞免疫荧光技术检测CCAR1在PK15细胞中的定位;采用qRT-PCR技术检测猪CCA R1基因的时空表达规律;采用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除PK15细胞的CCA R1基因,通过qRT-PCR、Western blot以及CCK8(cell counting kit 8)技术检测CCA R1基因敲除对细胞增殖能力及细胞增殖和凋亡相关基因表达的影响.结果表明,猪CCAR1基因的完整CDS区长3459 bp(MH301308.1),在PK15细胞的细胞质和细胞核中均有表达.大白猪和马身猪不同组织CCA R1的表达谱基本相似,在所检测的组织中均有表达,均表现为在肾和小肠中表达量最高,在脾、肝、小脑和肌肉中呈中度表达,在心和皮下脂肪中低表达;CCA R1基因在大白猪和马身猪初生、3月龄和6月龄3个年龄阶段的两种骨骼肌中也均有表达.CRISPR/Cas9基因编辑系统能有效降低CCA R1的表达,在转染48 h后,相比于对照组,试验组都对细胞增殖产生极显著抑制(P<0.01);CCAR1基因敲除后,细胞增殖标记基因Mki67表达水平显著下降(P<0.05),Wnt通路下游靶基因C-myc表达量显著下降(P<0.05),Wnt通路核心蛋白β-catenin和凋亡标记基因Caspase3的表达量无显著差异.CCAR1基因在猪不同组织和不同发育阶段均有表达,可能通过调控细胞增殖基因Mki67和Wnt通路下游靶基因C-myc的表达而影响细胞增殖,在猪的生长发育过程中起重要作用.
基金项目
三晋学者支持计划专项经费资助(2016)
三晋学者支持计划专项经费资助(2017)
国家自然科学基金(31872336)
山西省农业重点研发项目(201803D221022-1)
"山西省1331工程"资助(2017)
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