摘要
Rab蛋白是介导胞内活性蛋白转运的分子家族.恒定链(invariant chain,Ii)具有协助抗原肽转运、B细胞成熟和作为细胞因子的受体等免疫学功能.前期研究发现,鸡(Gallus gallus)Rab5a在细胞早期内吞体中与Ii结合,但不清楚是否还有其他转运蛋白有该特性.基于Rab7b分子定位于晚期内吞体,并与胞内分子转运相关,本研究探索了鸡Rab7b与Ii结合的分子结构特征.首先,用自行设计的引物扩增了鸡和小鼠(Mus musculus)Rab7b基因,并进行了氨基酸同源性比对分析;构建了含鸡Rab7b及其67位氨基酸突变体Rab7bQ67L的原核和真核重组质粒.其次,将含红色荧光蛋白和目的基因的重组质粒转染鼠巨噬细胞系Raw264.7,培养后用绿色荧光素(FITC)标记的鼠抗晚期内吞体蛋白1(LAMP1)抗体染色,观察目的蛋白在内吞体的定位.进一步将鸡Rab7b和Rab7bQ67L分别与Ii共转染293T细胞,观察它们与Ii的共定位.最后用拉下法和免疫印迹检测鸡Rab7b及Rab7bQ67L与Ii的结合.结果表明,所克隆获得的鸡Rab7b基因与预期大小一致,其开放阅读框为624 bp,编码208个氨基酸.鸡和鼠的Rab7b蛋白质结构相似性为74％.尽管鸡Rab7b和突变体Rab7bQ67L均能结合Ii,但只有Rab7b可以定位于晚期内吞体,而突变体却改变了该定位特性.综上所述,鸡Rab7b与Ii不仅在晚期内吞体共定位,而且还能互相结合;鸡Rab7b的第67位氨基酸影响其在细胞内定位而不影响与Ii结合.综上表明,Rab分子参与了Ii在细胞内细胞器的转运,为进一步研究Ii在细胞内的转运机制提供了新的途径.
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