摘要
旨在通过探索ICR品系小鼠精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSCs)的体外稳定培养,为别的品系小鼠和大动物的SSCs体外培养提供参考.本研究采集6〜8日龄ICR乳鼠的睾丸,用两步酶消化法(胶原酶和胰蛋白酶)和差速贴壁法来纯化SSC细胞.用不同的饲养层(小鼠胎儿成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,mEF)作为饲养层和层黏连蛋白与多聚赖氨酸联合铺板),不同的培养基(StemPro-34培养基和DMEM培养基),添加不同的生长因子(GDNF、LIF、EGF、bFGF、IGF1)来观察体外SSCs的生长.将传代至第6代的SSCs用免疫染色法和分子检测法来评估细胞增殖.最后将稳定增殖的SSCs移植到受体睾丸中进行功能鉴定.结果显示,通过两步酶消化法和差速贴壁法获得纯度约79％以上的SSCs细胞;mEF作为饲养层,StemPro-34作为培养基,组合添加GDNF、LIF、EGF、bFGF、IGF1生长因子能促进SSCs的体外长期培养;SSCs克隆集落用碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)染色、PLZF和UCHL1蛋白免疫荧光检测均显示为阳性,用反转录聚合酶链反应(reverse tran-scription-polymerase chain reaction,RT-PCR)和荧光实时定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)检测显示,克隆集落高表达多能基因和自我更新基因,说明体外培养的SSCs实现了稳定增殖;SSCs(带有报告基因EG-FP)移植到受体睾丸后,受体附睾中精子头部发出绿光,证明精子为供体SSCs来源.研究表明,本试验中的培养体系适用于ICR品系小鼠的体外培养,且稳定培养后的SSCs具有正常生物学功能.本研究为别的品系小鼠和大动物SSCs的体外培养提供了参考和借鉴.
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