畜牧兽医学报2021，Vol.52Issue(2) ：478-487.DOI:10.11843/j.issn.0366-6964.2021.02.020

凋亡相关斑点样蛋白敲除PK-15细胞系的建立及对PRV感染的影响

Establishment of Apoptosis Associated Dot Like Protein Knockout PK-15 Cell Line and Its Effect on Porcine Pseudorabies Virus Infection

翟云云 李佳佳 张爽 任子昱 金前跃 杜永坤 万博
畜牧兽医学报2021，Vol.52Issue(2) ：478-487.DOI:10.11843/j.issn.0366-6964.2021.02.020
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凋亡相关斑点样蛋白敲除PK-15细胞系的建立及对PRV感染的影响

Establishment of Apoptosis Associated Dot Like Protein Knockout PK-15 Cell Line and Its Effect on Porcine Pseudorabies Virus Infection

翟云云 1李佳佳 1张爽 1任子昱 1金前跃 2杜永坤 1万博1
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作者信息

  • 1. 河南农业大学动物免疫学国际联合研究中心,郑州450002
  • 2. 河南省动物免疫学重点实验室,郑州450002
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摘要

本试验旨在研究凋亡相关斑点样蛋白(ASC)的基因敲除对猪伪狂犬病病毒(PRV)感染PK-15细胞的影响.以慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因编辑技术,构建猪肾上皮细胞(PK-15)A SC基因稳定敲除细胞系,通过T7核酸酶检测靶基因的敲除效率;CCK-8试剂盒检测PK-15敲除ASC基因对细胞增殖的影响;采用流式细胞术检测PK-15以及PK15-ASC-/-细胞感染PRV-GFP 病毒的增殖差异;RT-PCR 检测PRV-gB 及 IFN-β、ISG15、IL-1βmRNA表达水平;Western blot检测PRV gE蛋白的表达;TCID50检测子代病毒感染力的滴定.结果表明:两对特异性sgRNA均能对ASC进行基因编辑,但经过T7核酸酶酶切检测进行基因编辑效率分析,结果表明,sgRNA2的基因编辑效率最高;CCK-8试剂盒检测细胞活力结果表明,PK-15以及PK15-4SC-/-细胞活力无影响;流式细胞仪检测结果表明PRV-GFP在PK15-ASC-细胞中的增殖显著低于PK-15细胞;定量RT-PCR结果表明,PRV-gB基因在PK15-ASC-/-细胞中的转录水平显著低于PK-15细胞,而IFN-β、ISG15基因在PK15-ASC/-细胞中的转录水平显著高于PK-15细胞;Western blot结果表明,PRV的gE蛋白在PK15-A SC-/-细胞中的表达显著低于PK-15细胞;滴度测定结果表明敲除ASC基因能够显著抑制子代病毒的增殖能力.本研究成功构建了PK15-ASC/-细胞系,并通过PRV感染试验证实敲除4SC基因可以抑制PRV在PK-15细胞中的增殖.

关键词

伪狂犬病病毒/凋亡相关斑点样蛋白/先天性免疫/猪肾上皮细胞

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基金项目

河南省重点研发与推广专项(科技攻关)(192102110191)

河南省重点研发与推广专项(科技攻关)(202102110100)

出版年

2021
畜牧兽医学报
中国畜牧兽医学会

畜牧兽医学报

CSTPCDCSCD北大核心
影响因子：0.729
ISSN：0366-6964
被引量2
参考文献量1
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