摘要
旨在对鸡肿瘤坏死因子受体相关因子6 (tumor necrosis factor(TNF) receptor-associated factor 6,TRAF6)和肿瘤坏死因子受体相关因子相互作用的具有叉形头相关结构域蛋白(TNF receptor associated factor(TRAF)-interacting protein with a forkhead-associated(FHA) domain,TIFA)进行序列分析,并进行蛋白质相互作用验证.本研究首先以鸡胚成纤维细胞提取的总RNA反转录产物为模板扩增鸡TRAF6和TIFA基因的CDS区,分别构建重组真核表达载体pCMV-HA-TRAF6和pEGFP-C1-TIFA;运用生物信息学软件ProtParam、SOP-MA、SWISS-MODEL、MegAlign和PSORTⅡ分别对鸡TRAF6和TIFA蛋白理化性质、二级和三级结构、氨基酸同源性、功能结构域保守性和亚细胞定位进行分析.将重组真核表达载体共转染细胞,通过荧光共定位和免疫共沉淀(Co-IP)试验验证鸡TRAF6和TIFA蛋白之间的相互作用.结果 ,成功扩增鸡TRAF6和TIFA基因,并构建其重组真核表达载体pCMV-HA-TRAF6和pEGFP-C1-TIFA.序列分析结果显示,鸡TRAF6和TIFA基因CDS区分别为1638和564 bp,共编码545和187个氨基酸,分子量约为62和22 ku.蛋白质二级和三级结构分析结果表明,鸡TRAF6和TIFA蛋白均以无规则卷曲和α螺旋为主.氨基酸同源性分析结果发现,鸡与人和其他哺乳动物TRAF6和TIFA蛋白的同源性分别为76.4％～80.3％和49.7％～53.3％,而与非洲爪蟾的同源性分别为69.4％和49.7％,并且鸡TRAF6和TIFA蛋白的功能结构域存在多个氨基酸位点变异.亚细胞定位预测结果表明,鸡TRAF6和TIFA蛋白主要定位在细胞核.荧光共定位和Co-IP试验结果显示,鸡TRAF6和TIFA蛋白在细胞核中具有共定位,并且存在相互作用.本研究结果显示,鸡与人和其他哺乳动物以及非洲爪蟾TRAF6和TIFA蛋白的同源性及功能结构域保守性均较低,但鸡TRAF6和TIFA蛋白能在细胞核中发生相互作用,这可为进一步研究鸡TRAF6和TIFA蛋白相互作用调控鸡相关病毒复制的作用机制奠定基础.
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