摘要
旨在深入研究非经典细胞焦亡的激活机制,本研究在体外构建非经典细胞焦亡模型,利用PCR方法扩增人源目的 基因Caspase-4、hGSDMD-FL和hGSDMD-p 30,使用无缝克隆的方法连接到相应的载体中,构建重组真核表达质粒pCMV MY&Caspase4、p3XFLAG-hGSDMD-FL和pcDNA3.1 hGSDMD-p30 MYC,利用VigoFect试剂转染到HEK293T细胞后,采用Western blot方法验证各蛋白的表达情况;通过质粒共转染的方法构建非经典的细胞焦亡模型,分别检测细胞上清中LDH的释放、GSDMD有无被切割为有活性的N端p30片段和荧光观察PI染色情况来确定非经典细胞焦亡模型是否构建成功.结果 显示:pCMV-MYC-Caspase-4、p3XFLAG-hGSDMD-FL重组质粒均成功构建,各蛋白于HEK293T细胞内均成功表达,质粒共转染后LDH分泌显著升高,Caspase-4将GSDMD全长片段切割为有活性N端GSDMDp30片段,荧光显微镜观察到明显的PI染色,表明非经典细胞焦亡模型体外构建成功.非经典细胞焦亡模型在体外的成功构建,为进一步研究其激活机制奠定了基础.
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