摘要
旨在采用CRISPR/Cas9编辑系统获得Wip1基因敲除的猪睾丸(swine testis,ST)细胞,为后续在细胞水平上探究Wip1基因对ST细胞增殖、凋亡的影响奠定基础.本研究将实验室已有的靶向Wip1基因第一外显子的两条sgRNA(sgWip1-1和sgWip1-2)分别连接到pX330-GFP和pX330-RFP载体,然后共转染ST细胞(从80～90日龄的猪胚胎睾丸组织中分离出未成熟的支持细胞).利用流式细胞仪收集红绿双荧光阳性的ST细胞,以用于单克隆细胞挑选.对得到的30个单克隆细胞进行基因型鉴定,并将PCR产物进行T-A克隆.结果显示,有29个单克隆细胞出现了基因片段敲除,Wip1基因的片段敲除效率为96.7％.其中单等位基因片段敲除的有5个,纯合双等位基因片段敲除的有8个,杂合双等位基因片段敲除的有16个.本研究高效地构建了 Wip1基因敲除的ST细胞,不仅为后续研究Wip1基因对ST细胞增殖、凋亡的影响提供了细胞模型,也为研究Wip1基因对公猪繁殖性能的影响奠定了基础.
基金项目
国家自然科学基金(32072690)
国家自然科学基金(31572378)
中国农业科学院科技创新工程(ASTIP-IAS05)
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