表达绿色荧光蛋白重组猪塞内卡病毒的构建及初步应用

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中文摘要：塞内卡病毒A(SVA)是新近发现的一种能够引起猪特发性水疱病及新生仔猪死亡为主要临床特征的病原微生物.该病呈世界性分布,给多个国家的养猪业造成了一定的经济损失.鉴于目前国内外尚无可用SVA商品化疫苗和抗病毒药物上市,本研究拟在实验室前期对SVA研究的基础上建立稳定表达绿色荧光蛋白报告基因的重组病毒,为体外高通量筛选具有抗SVA活性药物提供一种简单快速有效的工具.本研究在pEGFP-C1载体EGFP基因末端引入猪捷申病毒1型的2A基因,构建EGFP-P2A融合基因过度质粒,随后分别设计带有同源臂的克隆引物,通过同源重组技术将EGFP-P2A基因插入SVA毒株CH/HeN-2018基因组2A和2B基因间,并经测序鉴定,成功构建重组载体pSVA-EGFP.将pSVA-EGFP转染PK-15细胞,盲传至P2代,获得致使感染细胞病变明显、病变时间稳定的重组SVA荧光毒rCH/HeN-2018-EGFP.通过绿色荧光观察、RT-PCR和生长曲线测定,评估了重组毒株rCH/HeN-2018-EGFP和亲本毒株生长特性.并进一步通过药物细胞毒性试验和病毒感染试验对rCH/HeN-2018-EGFP作为潜在抗SVA药物筛选工具进行评价.结果表明,rCH/HeN-2018-EGFP与亲本毒株wtCH/HeN-2018和rCH/HeN-2018在PK-15细胞中具有相似的生长特性,且遗传稳定,在P10代能够稳定表达绿色荧光,插入的EGFP-P2A基因没有出现突变现象.抗SVA病毒感染试验结果表明,用终浓度20 μmol·L-1的姜黄素和110μmol·L-1黄芩苷预处理PK-15细胞2 h,通过观察荧光细胞的数量直观判断两种药物均能够抑制rCH/HeN-2018-EGFP在细胞中的复制,其中黄芩苷抑制效果极显著.随后在亲本毒株wtCH/HeN-2018感染试验进一步证实了黄芩苷对SVA病毒复制抑制的效果.本研究所构建的携带EGFP基因的重组SVA毒株能够高效稳定地表达绿色荧光蛋白,可以作为一种工具报告病毒应用于抗SVA药物和蛋白的筛选过程.

外文标题：Development and Application of Recombinant Senecavirus A Expressing the Green Fluorescent Protein

作者：

张晓战、杨磊、邓同炜、赵攀登、彭志锋、陈露露、郭懿文、夏艳勋、乔宏兴、边传周、王增

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作者单位：

河南牧业经济学院动物医药学院,郑州450046

河南农业大学动物医学院,郑州450046

关键词：

塞内卡病毒反向遗传操作系统报告病毒绿色荧光蛋白抗病毒药物筛选

基金：

国家自然科学基金河南省科技攻关项目河南省高等学校重点科研项目河南牧业经济学院青年博士启动基金国家级大学生创新创业训练计划项目

项目编号：

3200226419210211018621A2300062019HNUAHEDF008202010469018

出版年：

2021

DOI：

10.11843/j.issn.0366-6964.2021.010.029

畜牧兽医学报

中国畜牧兽医学会

畜牧兽医学报

CSTPCDCSCD北大核心

影响因子：0.729

ISSN：0366-6964

年,卷(期)：2021.52(10)

被引量2
参考文献量25