目的:探究高糖诱导体外培养的视网膜Müiller细胞自噬及凋亡的变化.方法:实验研究.将体外培养的SD大鼠视网膜Müller细胞根据不同糖浓度分为5.5 mmol/L葡萄糖组(正常组)及20、30、40、50 mmol/L高糖组,并对40 mmol/L高糖处理Müller细胞组采用不同时间3、6、12、24、36 h进行培养.使用蛋白免疫印迹法及细胞免疫荧光检测自噬指标LC3Ⅰ/LC3Ⅱ、自噬信号通路P62、Beclin-1蛋白表达及细胞定位;使用透射电镜及GFP-LC3慢病毒转染观察自噬小体的形成情况;使用TUNEL实验检测细胞凋亡状态.不同组别间数据比较采用单因素方差分析.结果:正常组及20、30、40、50 mmol/L高糖组中Müller细胞质的Beclin-1、P62及LC3Ⅰ/LC3Ⅱ蛋白相对表达量总体比较,差异均有统计学意义(F=131.21,P=0.029;F=197.25,P=0.012;F=100.02,P=0.045),其中与正常组比较各浓度高糖组Müller细胞质内Beclin-1、LC3Ⅰ/LC3Ⅱ蛋白均明显降低(P＜0.05),P62蛋白相对表达量明显增加(P＜0.001).正常组以及6、12、24、36 h高糖组中Müller细胞质的Beclin-1、P62及LC3Ⅰ/LC3Ⅱ蛋白相对表达量总体比较,差异均有统计学意义(F=98.46,P=0.015;F=109.48,P=0.004;F=99.27,P=0.032),其中6 h高糖组LC3Ⅰ/LC3Ⅱ、Beclin-1 蛋白明显增加(P=0.002、0.015),12、24、36 h高糖组与正常组相比较LC3Ⅰ/LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白均明显下降(P＜0.05),P62蛋白明显增加(P＜0.001).正常组及6、24 h高糖组视网膜Müller细胞中GFP-LC3转染阳性颗粒、自噬小体相对数量组间总体差异有统计学意义(F=240.49,P=0.014;F=198.98,P=0.00l),其中与正常组比较,6 h高糖组GFP-LC3转染阳性颗粒、自噬小体相对数量增加(P=0.002、0.029),24 h高糖组明显降低(P=0.019、0.036).正常组及6、24 h高糖组及3MA组视网膜Müller细胞凋亡指数分别为3.14±1.01、15.34±3.87、25.82±4.96、24.79±4.01,总体比较差异有统计学意义(F=234.12,P=0.003),与正常组比较,6、24 h高糖组TUNEL阳性细胞增多(P=0.022、0.039),24 h高糖组与6 h高糖组比较TUNEL阳性细胞进一步增加(P--0.017).结论:高糖诱导体外培养的视网膜Müller细胞早期自噬增加,细胞凋亡抑制,随着时间不断延长,高糖抑制自噬形成,增加细胞凋亡.高糖抑制自噬可能是促进Müller细胞凋亡的重要原因.
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