摘要
托品酮还原酶I (tropinone reductase I,TRI)是托品烷生物碱(tropane alkaloids,TAs)合成途径中游分支点处的关键酶,可引导托品酮代谢流进入TAs合成,因此是TAs代谢工程重要的靶标基因.本研究从木本曼陀罗(Datura arborea)中克隆到了一条新的TRI基因,命名为DaTRI2 (GenBank登录号为MH705164).DaTRI2基因cDNA全长1 135bp,与DaTRI序列一致性为96.8％,预测编码272个氨基酸.DaTRI2蛋白具备茄科TRI保守的结合NADPH的TGXXXGXG基序、结合底物托品酮的11个保守氨基酸残基以及发挥催化活性的N-S-Y-K四联体基序.进化关系上,DaTRI2和茄科的TRI成员聚为一支,与Datura属的TRI亲缘关系最近.对DaTRI2进行原核表达,纯化的重组蛋白能催化托品酮还原反应和托品氧化反应,最适pH值分别为8.0和9.6.DaTRI2在pH=6.4时,对托品酮的Km和Vmax分别为210.05 μmol· L-1和69.6 nkat· mg-1 protein,在pH=9.6时,对托品的Km和Vmax分别为188.03 μmol· L-1和114 nkat· m-1 protein.qPCR检测表明DaTRI2在幼叶中表达量最高,其次是须根.DaTRI2基因的克隆和酶活力分析为深入研究木本植物中TAs的生物合成分子机制奠定了基础,同时为TAs代谢工程提供了一个更高效的候选靶基因.
基金项目
国家重点研发计划课题(2016YFC0502604)
贵州省科技计划重大专项课题(黔科合平台人才[2017]5411-06)
贵州省科技创新人才团队建设专项资金(黔科合平台人才[2016]5624)
贵州省教育厅创新群体重大研究项目(黔教合KY字[2016]023)
贵州大学国家级重点培育项目(黔科合平台人才[2017]5788)
贵州省中药材现代产业技术体系建设项目(GZCYTX-02)
贵州大学引进人才科研项目(贵大人基合字[2017]58)
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