Mechanism of Huoxue Rongluo Recipe on regulating circadian clock protein Bmal1 to improve angiogenesis in bEnd.3 cells after oxygen-glucose deprivation/reperfusion injury
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维普
万方数据
目的 基于阴阳理论及活血荣络方(Huoxue Rongluo Recipe,HXRL)对脑梗死后血管新生的影响,探讨HXRL调控生物钟蛋白脑和肌肉芳烃受体核转位蛋白1(brain and muscle Arnt-like 1,Bmal1)促内皮细胞血管新生的作用机制.方法 采用Western blotting检测小鼠脑微血管内皮细胞株(bEnd.3)受到糖氧剥夺/复氧(oxygen-glucose deprivation/reperfusion,OGD/R)损伤后各时间点生物钟蛋白Bmal1和Clock的表达;利用染色质免疫共沉淀-测序分析(chromatin immunoprecipitation sequencing,ChIP-seq)明确Bmal1在全基因组中发挥的作用,以及对bEnd.3细胞生物进程、细胞组成及分子功能的影响.采用CCK-8法检测HXRL含药血清最佳干预浓度,敲降bEnd.3细胞Bmal1基因,设置对照组、模型组、HXRL含药血清组、si-Bmal1组和si-Bmal1+HXRL含药血清组,通过划痕、迁移、成管等实验检测细胞迁移及血管形成能力;采用免疫荧光检测各组血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和神经源性基因Notch同源蛋白1(neurogenic locus notch homolog protein 1,Notch1)表达;采用 Western blotting 检测 VEGF、基质金属蛋白酶 2(matrix metalloproteinases 2,MMP2)、Notch1 蛋白胞内结构域(notch1 intracellular domain,NICD)和 δ 样蛋白 4(delta-like protein 4,DLL4)蛋白表达.结果 bEnd.3细胞受到OGD/R损伤后,Bmal1及Clock蛋白表达逐渐升高,造模8、12、16、20 h后具有显著差异(P＜0.05、0.001).ChIP-seq提示Bmal1在内皮细胞中参与细胞发育、分化、增殖等进程,靶向调节VEGF、Notch1启动子区域.CCK-8实验结果显示,bEnd.3细胞受到OGD/R损伤后,10％的HXRL含药血清可有效改善细胞活力(P＜0.001).划痕、迁移及成管实验证实HXRL含药血清可有效改善bEnd.3细胞OGD/R损伤后的迁移能力及血管生成能力(P＜0.05、0.01、0.001),但在Bmal1敲降株中,该促进作用被抑制(P＜0.05、0.01、0.001).免疫荧光及Western blotting结果显示,HXRL含药血清可进一步升高OGD/R损伤的bEnd.3细胞中VEGF、MMP2、NICD、DLL4、Bmal1及Clock蛋白表达(P＜0.05、0.01、0.001),在Bmal1敲降株中,HXRL含药血清对VEGF、MMP2、NICD及DLL4的促表达作用被抑制(P＜0.05、0.01、0.001).结论 HXRL可有效促进内皮细胞经OGD/R损伤后的血管生成能力,其作用机制与调控生物钟Bmal1蛋白密切相关.
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