[目的]通过构建柑橘大实蝇(Bactrocera minax)BminOBP6的C末端截短突变体(TOBP6),比较野生型BminOBP6和突变体TOBP6对气味配体的结合能力,检测在不同pH条件下二者对气味配体结合能力的差异,为揭示BminOBP6与配体的互作机制提供参考.[方法]通过在线工具SWISS MODEL对BminOBP6进行同源建模,根据构建的3D模型确定将被切除的BminOBP6第6个α螺旋(α6)之后的C末端序列;设计特异性引物扩增BminOBP6的C末端截短突变体(TOBP6)的编码序列,即TOBP6;构建重组表达载体pET32a/TOBP6,将此重组载体与实验室保存的重组载体pET32a/BminOBP6分别转入原核细胞BL21(DE3)中,异源表达野生型BminOBP6及其突变体TOBP6;以1-NPN为荧光探针进行荧光竞争结合试验,检测BminOBP6和TOBP6在两种pH环境(pH 7.4和pH 5.0)下对1-十一醇和(+)-柠檬烯的结合能力.[结果]序列比对结果显示,BminOBP6与致倦库蚊(Culex quinquefasciatus)CquiOBP1的序列具有很高的相似性,为62.6％,远高于30％,因此选择以CquiOBP1的3D结构作为BminOBP6同源建模模板.模型显示BminOBP6的a6之后是由8个氨基酸残基(D117-P124)组成的C末端序列,即将被切除的C末端序列.在此基础上设计引物克隆获得了编码TOBP6的cDNA序列,并构建了其重组表达载体pET32a/TOBP6,该重组载体和pET-32a/BminOBP6重组载体分别转入大肠杆菌细胞中进行了异源表达.荧光竞争结合试验结果显示,在pH为7.4时,BminOBP6与1-十一醇和(+)-柠檬烯具有很强的结合能力,Ki值分别为6.89和9.50μmol·L-1.当pH降至5.0时,BminOBP6却丧失了对1-十一醇的结合能力,同时与(+)-柠檬烯的结合能力也大幅减弱,Ki值从9.50μmo1·L-1升至31.26μmol·L-1;而不论在何种pH条件下,TOBP6均丧失了对这两种气味配体的结合能力.[结论]pH在柑橘大实蝇BminOBP6与其配体结合和释放过程中发挥了重要作用,并且BminOBP6的C末端在配体的结合中起着关键作用.
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