[目的]热应激严重影响奶牛的生产和健康,是制约奶业持续健康发展的重要因素.DNA甲基化作为一种重要的表观遗传调控机制参与动物的热应激反应,但其在奶牛热应激过程中的作用和分子机制研究较少.研究通过检测奶牛热应激相关的DNA甲基化变化,筛选和验证DNA甲基化相关的关键基因,为奶牛热应激的表观遗传机制研究积累数据.[方法]以北京市三元绿荷金银岛牧场的24头中国荷斯坦牛(泌乳阶段及胎次相同)为研究对象,分别于春季(非应激期,2017年4月份)和夏季(热应激期,2017年7月份)采集试验个体的血液,提取DNA,共获得48份DNA样本.首先,随机选择其中15头奶牛,并随机分为3组,每组5份DNA样本混合,通过全基因组重亚硫酸盐测序法(Whole-genome bisulfite sequencing,WGBS)检测奶牛基因组DNA的甲基化状态,筛选差异甲基化区域(Differential methylation region,DMR;1000 bp windows,500 bp overlap,P＜0.05)及相关基因,利用 PROMO 和 Methprimer软件预测基因启动子的转录因子结合位点和CpG岛区.然后,39 ℃热处理牛乳腺上皮细胞(Bovine mammary gland epithelial cells,Mac-T)不同时间(24 h,48 h,72 h),MTT法检测细胞活力.最后,利用亚硫酸盐测序法(Bisulfite sequencing PCR,BSP)分别对春夏季的24头奶牛及39 ℃热处理不同时间的Mac-T细胞中目的基因启动子区的甲基化状态进行分析.[结果]通过WGBS共得到49 861个DMRs,其中一个DMR注释到基因GNAS复合体基因座(GNAS complex locus,GNAS)的启动子区,其整体甲基化水平在夏季热应激期极显著上调(P＜0.001),且该区域预测到一个352 bp的CpG岛,包含Sp1、C/EBP等重要转录因子的结合区域.24头奶牛个体中GNAS启动子区31个CG位点的整体甲基化水平在热应激期显著上调(P＜0.05),与WGBS结果一致,其中,21号(-113 bp,Chr1 3:57532733)和27号CG(-63 bp,Chr13:57532683)位点甲基化水平显著上调(P＜0.05).Mac-T细胞热处理48和72 h后,细胞活力极显著下降(P＜0.01),6NAS启动子的CG位点整体甲基化水平显著上调(P＜0.05),21号和27号CG均为显著上调的差异甲基化位点,与个体水平结果一致.[结论]热应激会引起奶牛GNAS启动子甲基化水平增加,GNAS是奶牛热应激DNA甲基化调控的潜在靶基因.
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