[目的]抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5已获得中国进口加工原料安全证书,建立一种特异、准确、灵敏的抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5转化体特异性实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法,为抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5在中国的安全监管提供精准测量技术.[方法]首先利用Beacon designer 8.0软件对抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5转化体5'端旁侧序列设计18对引物探针,结合1对罗萨里奥农业生物技术学院公司提供的引物探针,随后采用qPCR技术对引物探针进行特异性筛选,遴选出1对候选引物探针;设置实时荧光定量PCR的引物/探针浓度梯度,优化qPCR方法的反应体系;设置不同类型的特异性测试样品测试方法的特异性;以纯合抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5基因组DNA作为标准样品,梯度稀释成标准溶液模板,绘制标准曲线,考察qPCR方法的线性动态范围,配置拷贝数比值为5％、1％和0.1％的测试样品,评价定量方法的准确性;配置拷贝数比值为0.05％和0.025％的样品,测试方法的检出限;拷贝数比值为0.1％的样品经16次定量测试,确定方法的定量限;最终确定抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5转化体特异性实时荧光定量PCR检测方法的关键技术参数.8家有资质单位对该定量PCR方法的特异性、检出限、定量限、准确性等进行验证,采用柯克伦法和格拉布斯法评估qPCR方法的重复性和再现性,利用线性最小二乘法对准确性样品测试结果的测量不确定度进行预评定.[结果]通过特异性筛查确定RBORD-F1/RBORD-R1/RBORD-P1引物探针为候选组合,建立了抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5转化体特异性qPCR方法,扩增片段为138 bp,优化的反应体系引物终浓度为0.4 μmol·L-1、探针终浓度为0.2 μmol·L-1;IND-ØØ41Ø-5和Lectin标准曲线的线性动力学范围为33-83 190 copies的基因组DNA,该方法可准确定量5％、1％和0.1％含量的IND-ØØ41Ø-5测试样品,偏差和相对标准偏差(RSD)均小于25％;确定检出限为0.05％、定量限为0.1％.8家实验室间联合验证该方法稳定性好、特异性强,检出限为0.05％,定量限为0.1％,且具备良好的实验室间重复性和再现性,经测量不确定度预评定后,获得5份抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5测试样品的测量结果分别为(0.10±0.02)％、(0.53±0.09)％、(1.05±0.18)％、(2.05±0.34)％和(5.18±0.87)％,结果准确可靠.[结论]成功建立了抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5转化体特异性实时荧光定量PCR检测方法,能够实现抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5转化体成分的精准定量检测.
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