[目的]DELLA蛋白属于植物特有的GRAS蛋白家族,是赤霉素信号转导途径中的重要调控因子,在植物生长发育和抵御逆境胁迫中发挥着重要作用.克隆欧洲葡萄VvGAI1,并对其进行亚细胞定位、蛋白互作和表达分析,为进一步研究DELLA蛋白在葡萄抗寒反应中的调控功能奠定基础.[方法]以酿酒葡萄品种'霞多丽'叶片为试材,采用同源克隆的方法获得VvGAI1序列.利用生物信息学方法分析该基因的序列特征,使用DNAMAN及MEGA7.0 对VvGAI1 蛋白序列及拟南芥序列进行多序列比对并构建系统进化树.通过亚细胞定位确定VvGAI1 蛋白在细胞中的表达位置;利用酵母试验验证VvGAI1 蛋白的转录激活活性;利用酵母双杂交和双分子荧光互补试验验证VvGAI1蛋白与VvJAZ9蛋白的互作关系;利用VvGAI1原核表达蛋白制备anti-VvGAI1兔源多克隆抗体;利用Western Blot技术检测VvGAI1 蛋白在低温下的表达情况;通过相对电导率分析外源喷施茉莉酸和赤霉素对葡萄抗寒性的影响.[结果]从'霞多丽'叶片中克隆得到VvGAI1,其ORF为 1 773 bp,编码590个氨基酸,位于第1条染色体,含有1个外显子,无内含子.VvGAI1蛋白相对分子质量为64.87 kDa,理论等电点pI为5.31,属于酸性不稳定亲水蛋白.VvGAI1具有高度保守的DELLA和GRAS结构域,属于植物GRAS家族的DELLA蛋白.蛋白聚类分析显示VvGAI1与拟南芥AtGAI和烟草NtGAI1亲缘关系较近.亚细胞定位与转录自激活结果显示VvGAI1是一个定位于细胞核中且具有转录激活活性的转录因子.酵母双杂交和双分子荧光互补试验也证实VvGAI1与VvJAZ9具有互作关系.将VvGAI1克隆至原核表达载体构建pET28b-VvGAI1重组表达载体,转化至大肠杆菌BL21中经16℃、1.0 mmol·L-1异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达获得VvGAI1-His融合蛋白,再经抗原免疫,血清纯化后制备得到anti-VvGAI1兔源多克隆抗体.制备的anti-VvGAI1抗体可以特异性检测'霞多丽'葡萄中的VvGAI1 蛋白.Western Blot结果表明,低温处理下葡萄原生质体中VvGAI1 蛋白呈先上升后下降的表达趋势,VvGAI1 蛋白响应低温诱导表达.与对照相比,50 μmol·L-1 茉莉酸甲酯(MeJA)处理可以提高葡萄的抗寒性,50 μmol·L-1 赤霉素(GA3)处理使葡萄对寒冷变得敏感.[结论]葡萄VvGAI1是一个与VvJAZ9相互作用的转录因子,VvGAI1对低温胁迫有响应,外源茉莉酸能够正调控冷胁迫反应,而赤霉素负调控冷胁迫反应.
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