[目的]细胞质雄性不育由细胞质基因组(主要是线粒体基因组)控制,在杂交种的育种和生产中起重要作用.长期以来,我国烟草种植以不育系和杂交种为主,其面积占烟草总种植面积的 80%以上,不育类型均为sua-CMS,但该不育类型的控制基因、不育机制尚不清楚.COXⅡ是细胞色素氧化酶(COX)的第二亚基,由线粒体基因组编码.在sua-CMS烟草不育系中,COXⅡ末端发生多个碱基变异,导致C端编码蛋白Thr257 被Ser取代.研究sua-CMS烟草COXⅡ功能,为阐明sua-CMS烟草不育分子机制奠定基础.[方法]以 4 组sua-CMS不育系和可育对照为材料,RNA印迹杂交和qRT-PCR方法分析COXⅡ在sua-CMS不育系和可育对照之间的转录本、基因表达差异,Western杂交、COX酶活性试验分析COX蛋白表达和COX酶活性,并测定ATP含量;将可育烟草的COXⅡ在sua-CMS不育系中过表达,研究COXⅡ过表达对COXⅡ表达量、COX酶活性、ATP含量以及烟草雄蕊发育的影响.[结果]通过对COXⅡ多序列比对,发现C端Thr257 在物种间高度保守,表达分析显示不育系中COXⅡ转录本显著低于可育对照,COXⅡ在不育系烟草中的表达量只有对照的 0.3%—0.4%,COX蛋白表达量和COX酶活性均显著低于可育对照,ATP含量为可育对照的52%.将可育烟草COXⅡ在不育系烟草中过表达,转基因植株COXⅡ在花芽中的表达量最高提高 171 倍,COX酶活性提高 70%,ATP含量提高 90%,但转基因植株在花药中的COXⅡ表达量、COX酶活性和ATP含量等各项指标均低于可育对照.转基因植株的花药形态发生了明显的改变,并出现了花药壁的分化,但花药内无胞母细胞分化,最终也无花粉粒产生.[结论]sua-CMS烟草不育系COXⅡ变异影响COX功能,是其花药能量缺陷的重要原因,也是影响花药发育的一个重要因素.
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