目的:以水牛角鉴别为例建立中药重组酶介导扩增(Recombination-aid amplification,RAA)快速鉴别方法,用于水牛角及其混伪品牦牛角的鉴别.方法:通过比较水牛角及其混伪品牦牛角基原物种的线粒体基因组序列差异,寻找高变异区域,根据变异位点设计水牛角正品水牛的特异性RAA鉴别引物SNJ-1.F和SNJ-1.R及荧光探针SNJ-1.probe,使用碱裂解法提取DNA,优化RAA反应体系,在37℃下恒温孵育15 ～20 min,通过凝胶电泳及实时荧光监测反应结果,使用DNA测序方法验证RAA鉴别结果的准确性.结果:在37℃恒温孵育20 min后,水牛角RAA产物凝胶电泳图谱出现约140 bp特异性鉴别条带,使用实时荧光RAA鉴别时,水牛角正品均在6.21～8.37 min出现特异性扩增,牦牛角样品均在10.08 min后才出现扩增,COI片段DNA测序鉴别结果与荧光RAA鉴别结果相吻合.结论:特异性RAA技术可在20 min内快速鉴别水牛角,可用于水牛角药材、饮片及其制品的快速现场鉴定.该方法具有简单、快速、无需大型仪器等特点,在中药现场鉴定、药检抽查等方面有着广阔的应用前景.
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