摘要
目的:探究顺铂(CDDP)诱导C57BL/6J小鼠耳蜗螺旋神经元(SGNs)凋亡过程中Cav1.2的作用及其可能的机制.方法:动物实验:选取8周龄雄性C57BL/6J小鼠分为以下两组(10只/组):生理盐水组(Control组)和顺铂给药组(Cisplatin组).Control组每天腹腔注射生理盐水,Cisplatin组每周期前4 d以3 mg/kg的剂量进行顺铂腹腔注射,后10 d每日注射生理盐水,重复三个周期.给药结束后,听性脑干反应(ABR)检测小鼠听力阈值变化;小鼠内眦采血,并断颈取耳蜗,超氧化物歧化酶(SOD)以及丙二醛(MDA)试剂盒检测血清及耳蜗组织的SOD活性和MDA含量;免疫印迹法(Western blot)检测耳蜗组织相关凋亡蛋白表达;苏木精-伊红HE染色观察小鼠耳蜗螺旋神经节形态学变化;TUNEL染色观察小鼠耳蜗SGNs凋亡情况;免疫荧光观察耳蜗SGNs上Cav1.2的分布和表达.细胞实验:原代培养SGNs,根据CCK8选择顺铂5 μmol/L干预12 h并随机分为:对照组(Control)、溶剂组(DM-SO)、Cav1.2阻断剂组(N)、顺铂组(Cisplatin)、顺铂与Cav1.2阻断剂共同孵育组(Cisplatin+N).Western blot检测Cav1.2蛋白表达;Hoechst33342染色观察各组SGNs凋亡情况,流式细胞术检测各组SGNs凋亡率,Western blot检测相关凋亡蛋白的表达,CA2+探针检测细胞内钙离子浓度变化,线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)检测膜电位变化,线粒体超氧化物指示剂(MitoSOXTM-red)检测线粒体释放ROS情况.结果:动物实验:与Control组相比,Cisplatin组小鼠听力阈值升高(P＜0.01),血清及耳蜗组织MDA含量、耳蜗组织凋亡蛋白Cleaved-caspase-3、Bax蛋白水平和TUNEL阳性率、Cav1.2蛋白表达水平等均明显升高(P＜0.05,P＜0.01);血清及耳蜗组织SOD活性、耳蜗组织抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白水平和SGCs密度均明显降低(P＜0.05,P＜0.01).细胞实验:与Control组相比,Cisplatin组的Cav1.2表达、细胞凋亡率、Cleaved-caspase-3、Bax蛋白水平、细胞内钙离子浓度以及ROS释放均明显增加(P＜0.05,P＜0.01);而细胞的Bcl-2蛋白水平和线粒体膜电位则明显降低(P＜O.01);Cav1.2阻断剂可部分逆转上述改变(P＜0.05).结论:顺铂可能通过上调Cav1.2促进钙内流,进而使线粒体ROS增多,引起SGNs氧化应激损伤从而诱导线粒体途径的细胞凋亡.
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