目的:针对铁皮石斛ISSR的反应特点,建立稳定可靠的ISSR分子指纹标记反应体系,为进一步研究铁皮石斛的居群差异奠定基础.方法:通过筛选引物并设定影响铁皮石斛ISSR反应的诸因子的不同浓度,检测ISSR不同反应体系的扩增效果;通过分析非特异性条带的产生原因并进行条件优化,建立铁皮石斛ISSR稳定可靠的反应体系.结果与结论:首次建立了可用于铁皮石斛ISSR-PCR分析的最适宜的反应体系:25 μLPCR反应体系中,10×Taq酶配套缓冲液,1.5 U Taq DNA聚合酶,1.2～1.8 mmol·L-1 MgCl2,80 μmol·L-1 dNTP,0.2μmol·L-1引物,DNA模板约20 ng,退火温度52～60℃;实验表明:Taq酶质量、DNA模板品质、退火温度等对ISSR反应结果具有较大影响.所建立的铁皮石斛ISSR反应体系具有标记位点清晰、反应系统稳定、检测多态性能力较强、重复性好等特点,可以较好地应用于铁皮石斛的居群鉴别及居群分子生态的研究.
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