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胰腺癌细胞源性细胞外囊泡的基础研究

Basic research of pancreatic cancer cell-derived extracellular vesicles

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目的 分离胰腺癌细胞(PANC-1)和人胰腺导管上皮细胞(HPDE6-C7)细胞培养上清液中的细胞外囊泡,分别比较微小RNA(miRNA,miR)-483-5p在两种细胞及其所分泌的细胞外囊泡中的差异性表达.方法 超速离心法制备去除胎牛血清源性囊泡的完全培养基,细胞计数试剂盒(CCK-8)检测超速离心前(对照组)与超速离心后(实验组)的完全培养基对细胞增殖作用的差异;用去除血清囊泡的完全培养基培养细胞,超速离心方法提取细胞外囊泡,用二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒和纳米颗粒跟踪分析(NTA)检测细胞外囊泡(EVs)的浓度;用透射电镜、NTA、蛋白质印迹法(Western blot)鉴定其是否符合细胞外囊泡特征.定量即时聚合酶链反应(qPCR)检测miR-483-5p在两组细胞及其分泌的细胞外囊泡中的表达.CCK-8增殖实验和qPCR实验的结果采用t检验分析.结果 CCK-8增殖实验结果显示48 h和72 h后,HPDE6-C7的实验组与对照组之间差异无统计学意义(0.674±0.036比0.671±0.016,=0.315,P48 h ＞0.05;0.890±0.027比0.925±0.099,=0.581,P72 h ＞0.05);PANC-1的实验组与对照组之间差异无统计学意义(0.759±0.004比0.761±0.016,=0.249,P48 h ＞0.05;1.114±0.025比1.145±0.014,t=1.898,P72 h ＞0.05);透射电镜:细胞外囊泡呈“茶杯托盘”状、NTA结果:98％ PANC-1源性细胞外囊泡的直径为130.0 nm、98％HPDE6-C7源性细胞外囊泡的直径为129.7 nm;Western blot实验显示:细胞外囊泡表现为CD63、TSG101阳性,而GM130为阴性;蛋白浓度测定试剂盒和NTA分析测得PANC-1和HPDE6-C7源性的细胞外囊泡浓度分别为:1.5 g/L、1.510 11颗粒/毫升和1.3 g/L、1.610 11颗粒/毫升;与HPDE6-C7比较,PANC-1中miR-483-5p的表达显著增加(2.820±0.180比1.000±0.006,t=-17.539,P＜0.01);与HPDE6-C7源性细胞外囊泡比较,PANC-1源性细胞外囊泡中miR-483-5p的表达显著增加(3.503±0.265比1.002±0.084,t=-15.582,P＜0.01).结论 超速离心法去除胎牛血清源性囊泡的完全培养基不影响细胞的正常增殖;鉴定结果显示所分离的沉淀符合细胞外囊泡的特征;根据NTA的结果可以判断其应归类于小细胞外囊泡;qPCR结果表明,miR-483-5p在PANC-1和其分泌的细胞外囊泡中均为高表达.

徐锦翔、刘尚龙、孙钰淇、李泽群、刘恒健、张丹、任远中、周岩冰

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青岛大学 266071

青岛大学附属医院胃肠外科 266005

胰腺癌 细胞外囊泡 超速离心 微小RNA-483-5p

国家自然科学基金国家自然科学基金山东省重点研究开发项目

81572314818028882018GSF118088

2020

中华实验外科杂志
中华医学会

中华实验外科杂志

CSTPCD北大核心
影响因子：0.759
ISSN：1001-9030
年,卷(期)：2020.37(1)
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