查看更多>>摘要:目的:单因素试验研究大豆磷脂酶D(phospholipase D,PLD)的固定化工艺以及固定化PLD催化合成大豆磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine,PS)的最佳工艺.方法:首先通过非极性溶剂辅助Stöber法制备纳米级介孔二氧化硅作为固定化酶的载体,通过吸附-沉淀-交联方式将PLD固定,单因素试验优化固定化条件,并对固定化后的PLD进行结构表征和热稳定性及贮存稳定性研究;然后利用固定化PLD以大豆卵磷脂和L-丝氨酸为底物催化合成PS,并通过单因素试验确定最佳合成工艺;最后对固定化PLD的循环使用性能进行研究.结果:非极性溶剂辅助 Stöber 法制备的介孔二氧化硅 BET 比表面积为948 m2/g,气孔体积为 1.35 cm3/g,孔径为 8.20 nm,平均粒径为 335.10 nm,扫描电镜确定载体的形貌为近球形结构;当加入 5.00 mL乙醇、1.00 mL酶液(温度为 35℃、pH为 6.50)、0.40 mL戊二醛时,固定化PLD的相对酶活达到最大值(88.39%±1.00%),蛋白固定化率为 80.76%±1.30%;70℃时游离PLD的相对酶活剩余 15.30%,而固定化PLD的相对酶活仍然有 66.40%,且游离PLD被固定化后半衰期由 20d延长到 50d;当乙酸乙酯与乙酸钠/醋酸缓冲溶液的比为 6∶1,卵磷脂与L-丝氨酸的质量比为 1∶8,反应温度为40℃,pH为 6.50,固定化PLD的加入量为 40%,反应时间为 12h时,PS的产率达 86.60%±1.40%,纯度为90.30%,且固定化PLD循环使用 7 次PS的产率仍有 61.70%±1.60%,而游离PLD循环使用 4 次PS的产率只剩余 21.60%±1.80%.结论:介孔二氧化硅固定化PLD的稳定性、催化性能均显著提高,实现了PLD的回收重复使用,降低了生产成本;同时为PS的固定化酶法工业化生产提供技术支持.