查看更多>>摘要:黄颡鱼杆套病毒(Yellow catfish nidovirus,YCNdV)是近年来在养殖黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)中新发现的病毒性病原,为找到灵敏检测该病毒的方法,本研究根据YCNdV的衣壳基因序列设计特异性引物及探针,对反应体系和反应条件进行优化,建立了TaqMan qPCR方法,并与套氏PCR进行了临床样品的检出率比较.结果显示:反应体系优化后的引物和探针终浓度分别为 0.4 μmol/L和 0.1 μmol/L,获得的最佳退火延伸温度为58℃,该条件下,最低检测限为 4 copies的pMD19-YCNdV.cap质粒标准品;标准曲线线性关系好且线性范围广(3.37×1010~3.37×100 copies/μL),相关系数(R2)为0.998 4,扩增效率为 91.3%;特异性检测结果表明,与黄颡鱼小RNA病毒(Yellow catfish picornavirus,YCPrV)、草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型(Grass carp reovirus genotype Ⅱ,GCRV-Ⅱ)、鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)、大口黑鲈弹状病毒(Micropterus salmoides rhabdovirus,MSRV)、大口黑鲈蛙虹彩病毒(Largemouth bass virus,LMBV)、传染性脾肾坏死病毒(Infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV)、鲤浮肿病毒(Carp edema virus,CEV)和锦鲤疱疹病毒(Koi herpesvirus,KHV)均无交叉扩增信号;重复性实验结果显示,组间和组内变异系数均小于 0.6%;对保存的 32 份疑似黄颡鱼杆套病毒感染样品进行检测,结果表明,TaqMan qPCR检出率较套氏PCR高 9.37 个百分点;TaqMan qPCR检测发病黄颡鱼各组织发现,在脾、鳃和肾中YCNdV病毒载量显著高于其它组织.以上结果表明,本研究建立的TaqMan qPCR检测方法具有良好的特异性、重复性和超高的灵敏度,可用于YCNdV的定量检测,为YCNdV引起疾病的早防早治提供可靠检测手段.