查看更多>>摘要：[目的]乙酰辅酶A合成酶(ACS,EC 6.2.1.1)是细胞代谢过程中的一种重要酶,能在ATP供能的条件下催化乙酸与辅酶A生成乙酰辅酶A.此前研究发现,橡胶树中的一个ACS成员,HbACS2,影响乳管细胞中乙酸的代谢平衡,与橡胶树胶乳再生能力密切相关,然而该酶的酶活调控机制尚不清楚.有关微生物和模式植物中的研究表明,ACS酶活与其关键氨基酸位点及某些关键赖氨酸位点的乙酰化修饰状态有关.因此,探究HbACS2的酶活调控机制,对其关键氨基酸进行筛选十分必要.[方法]针对HbACS2的氨基酸组成特点,本试验选择HbACS2中3个保守的赖氨酸(K)位点(K298,K342和K723),通过定点突变方式,分别将它们替换为丙氨酸(A)、精氨酸(R)和谷氨酰胺(Q),并构建原核表达载体.随后这些变体蛋白与野生型蛋白通过原核表达体系进行诱导、表达和Ni-NTA琼脂糖纯化,并以纯化的野生型蛋白作为对照,采用体外酶活分析方法比较野生型和变体蛋白在底物乙酸结合能力及酶活方面的差异.[结果]HbACS2的K723位点突变对酶活性影响最为显著,K723A和K723R变体蛋白完全失去酶活,K723Q的酶活性降低了180倍.此外,K298位点的突变也显著降低了变体蛋白的酶活性,改变了对乙酸的亲和力,其中K298Q变体蛋白变化最大,其酶活降低17.85倍,Km=0.06 mmol/L,亲和力增加了6.5倍;K298A的酶活降低了约4倍,Km=0.754 3 mmol/L,对底物的亲和力降低了接近一倍;K298R的酶活降低了约3.7倍,Km=0.182 7 mmol/L,对底物的亲和力增加了一倍;相比之下,K342位点的突变,对3个变体蛋白的酶活影响最小,其中,K342R变体蛋白的酶活降低了2.75倍,Km=0.074 mmol/L,亲和力增加了5.3倍,而K342A和K342Q的酶活则分别降低了42%和14%,对乙酸的结合力增加了34%和17%.[结论]该研究结果证实了HbACS2中关键赖氨酸位点对其酶活和底物亲和力影响很大,为进一步揭示ACS活性调控机制提供了参考依据.
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