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生物技术通报
生物技术通报

路铁刚

月刊

1002-5464

biotech@caas.cn

010-82109925，82109903

100081

北京海淀区中关村南大街12号

生物技术通报/Journal Biotechnology BulletinCSCD北大核心CSTPCD
查看更多>>本刊客观报道国内外生物技术领域基础研究成果及其在农、林、牧、渔及医药、食品、轻工、环保领域中的应用和产业化趋势。内容包括基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程、生化工程、蛋白质工程以及生物工程的应用、研究现状和新的实验技术与方法等。
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    利用Cas9TX实现非病毒TRAC定点整合制备T细胞

    崔海洋谭淼全壮陈红利...
    190-197页
    查看更多>>摘要：[目的]Cas9TX是Cas9 的变体,能够显著降低基因编辑过程中染色体易位,大幅提升基因编辑的安全性.研究Cas9TX替换Cas9 实现基因定点敲入的可行性.[方法]首先,利用His标签蛋白纯化技术制备Cas9TX蛋白,并在细胞水平上通过绘制EC50 和核酸酶裂解动力学曲线等进行功能验证.其次,以RNP和dsDNA混合物电转的方式编辑体外激活的T细胞,流式检测定点敲入的效率.最后,探讨了供体模板进行稳定性修饰提升定点敲入效率的可行性.[结果]制备的Cas9TX在T细胞TRAC基因的A、R和S靶点的敲除效率分别为 71.8%、81.0%和 79.9%,具有与Cas9 相当的基因敲除效率.在TRAC 1 号外显子分别设计的dsDNA供体模板(2A-GFP编码序列)和ssDNA供体模板(+GTC bp),发现Cas9TX RNP定点敲入两种模板的效率均显著低于Cas9 RNP.通过DNA修饰制备防TREX2 核酸外切酶降解的供体模板,不能提升Cas9TX RNP定点敲入的效率.[结论]Cas9TX RNP在TRAC三个靶点的基因敲除方面可以替代Cas9 RNP使用,但定点整合外源基因的效率约为Cas9 RNP的一半.为Cas9TX应用于基因定点敲入提供了重要参考.

    Cas9TX定点整合RNPdsDNACRISPR/Cas9

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    辣椒UGT基因家族的鉴定及表达分析

    吴慧琴王延宏刘涵司政...
    198-211页
    查看更多>>摘要：[目的]鉴定分析辣椒UGT基因家族成员的结构和功能,为解析辣椒多糖糖基化分子机制奠定基础.[方法]利用BioEdit、BLASTP和Pfam比对搜索辣椒UGT成员;利用CDD和HMMER数据库验证保守结构域;利用ExPASy、Cell PLOC、MAGA X、MG2C、GSDS、STRING等分析预测蛋白理化性质、系统发育、染色体定位、基因结构和蛋白互作;利用转录组数据和实时荧光定量PCR分析辣椒UGT基因在各器官发育过程中的表达模式.[结果]从辣椒基因家族中鉴定到的 140 个辣椒UGT家族成员,编码的氨基酸数量介于 253-534 之间,等电点在 4.7-8.45 之间;CaUGTs蛋白大多数定位于细胞外,少部分定位于质膜和叶绿体中;分布在 17 个组中,定位于 12 条染色体上,其中 25 个成员定位在第 12 条染色体(Chromosome 12,chr.12);所有成员均包含保守结构域motif 1、motif 3;响应与植物生长发育、胁迫有关的作用元件.辣椒UGT基因在不同组织、逆境胁迫及激素应答下的表达模式分析表明,UGT基因具有组织特异性表达差异,在花、果实发育阶段表达相对较高;在ABA、GA3、高温以及低温胁迫条件下,表达被显著诱导增加或者降低,在发育的特定阶段CaUGTs成员可能发挥不同的作用,很可能参与了调控辣椒逆境胁迫条件下的防御应答反应.[结论]140 个辣椒UGT成员在分布及结构上存在多样性,而组内成员之间高度相似,CaUGTs基因可能在辣椒植株生长发育过程中响应非生物胁迫.

    辣椒UGT基因家族生物信息分析成员鉴定功能预测表达分析

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    基于转录组和WGCNA筛选大葱雄性不育相关基因

    岳丽昕王清华刘泽洲孔素萍...
    212-224页
    查看更多>>摘要：[目的]挖掘大葱雄性不育相关的特异性模块并筛选核心基因,为后续深入解析大葱雄性不育分子机制提供理论依据.[方法]以大葱可育株MF和不育株MS不同发育时期的花蕾为研究对象,基于转录组测序和加权基因共表达网络分析(weighted gene co-expression network analysis,WGCNA),鉴定与大葱雄性不育相关的特异性模块,筛选核心基因.[结果]通过WGCNA分析,将 8320 个基因划分为 18 个共表达模块,获得 3 个与大葱不育株MS花粉败育高度相关的特异性模块(blue、midnightblue和black模块).功能富集分析表明,大葱不育株MS的花粉败育与苯丙素生物合成、角质和蜡质生物合成、淀粉和蔗糖代谢、α-亚油酸代谢和脂肪酸延长等多种代谢过程密切相关.根据模块内基因的连接度以及基因意义,鉴定得到atpB、TPS9、TPD1、BHLH35 等核心基因,可能在大葱花粉发育中起关键调控作用.实时荧光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction,RT-qPCR)结果显示,核心基因的表达量在MF和MS不同发育时期的花蕾中差异显著,且表达趋势与转录组学测序结果一致.[结论]鉴定了3 个与大葱花粉败育高度相关的特异性模块,筛选到atpB、TPS9、TPD1 等大葱花粉发育相关的核心基因,并发现大葱花粉败育主要涉及苯丙素生物合成、角质和蜡质生物合成、淀粉和蔗糖代谢、α-亚油酸代谢和脂肪酸延长等过程.

    大葱雄性不育加权基因共表达网络分析转录组测序核心基因

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    铅污染土壤中解磷菌对玉米根际土壤性质和微生物群落结构的影响

    温绍福江润海朱城强张梅...
    225-237页
    查看更多>>摘要：[目的]探究解磷菌及其发酵产物在铅污染土壤中对玉米(Zea mays L.)根际土壤性质和微生物群落组成和多样性的影响.[方法]在筛选具有耐铅解磷功能的巴氏克雷伯氏菌(Klebsiella pasteurii)的基础上,采用盆栽实验在铅污染土壤中培育种植玉米,在其根际施加LB培养基、上清液(菌剂分泌物)、菌液(只含菌体细胞)和发酵液(上清液+菌体细胞),并设置无菌水对照,探究解磷菌对根际土壤理化性质及微生物群落结构的影响.[结果]巴氏克雷伯氏菌的上清液、菌液和发酵液对玉米根际细菌群落多样性并无显著影响,而菌液显著增加了土壤真菌群落的Shannon指数和Chao指数;菌株的上清液、菌液、发酵液均增加了拟杆菌门(Bacteroidetes)与放线菌门(Actinobacteria)等耐重金属的微生物类群的相对丰度,同时上清液、发酵液增加了变形菌门(Proteobacteria)和被孢霉门(Mortierellomycota)的丰度,上清液提高了鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、芽球菌属(Blastococcus)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)、古根菌属(Archaeorhizomyces)的相对丰度.此外,对玉米根际土壤差异菌属进行皮尔逊相关性分析,有 7 组差异菌属之间为正相关性,揭示了不同微生物菌属之间更趋向于形成互利共生关系.菌株的上清液、菌液、发酵液均显著增加了土壤酸性磷酸酶(Acp)的活性,其中在发酵液处理组中玉米根际土壤Acp活性最高为 574.44 mg/g,24-1,施用上清液、菌液显著增加了根际土壤中碱解氮(AN)的含量,较对照组分别增加了 47.4%、39.5%,三个处理组均显著降低了土壤pH值.通过冗余分析(RDA)发现土壤AN、Acp、pH值、可溶性磷(AP)是影响微生物群落结构的主要影响因素.[结论]外源施用解磷菌及其发酵产物有利于改善铅污染土壤肥力质量,影响土壤微生物群落的组成和结构,为铅污染农田接种解磷菌并提高土壤养分、改善土壤微生物群落结构提供了理论依据.

    重金属污染土壤解磷菌微生物群落结构土壤性质

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    基于根表真菌群落与病原菌鉴定探究'宁杞5号'枸杞根腐病的发生机制

    张亚亚李盼盼高惠惠贾晨波...
    238-248页
    查看更多>>摘要：[目的]比较两种植区易感病品种'宁杞 5 号'枸杞健康株和患病株的根表真菌群落组成和分离到的腐根真菌,明确'宁杞 5 号'根腐病的病原菌,探究两种植区'宁杞 5 号'根腐病的发生原因.[方法]采用高通量测序技术研究枸杞根表真菌群落的组成特征,采用组织分离法从两种植区枸杞腐根中分离腐根真菌,基于形态学和ITS、EF-1α基因序列对腐根真菌进行分类学鉴定,依据科赫法则进行致病性研究.[结果]两种植区'宁杞 5 号'枸杞健康株和患病株之间的根表真菌群落组成均表现出明显差异,主要体现在患病后镰刀菌属(Fusarium)相对丰度升高,被孢霉属(Mortierella)相对丰度降低,伴随着Fusicolla和Pseudogymnoascus等未知类群丰度增加,而两种植区健康株根表真菌群落结构趋于一致.自QXBZ腐根分离到 36 株真菌,分别鉴定为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、腐皮镰刀菌(F.solani)、红贝俄式孔菌(Earliella scabrosa)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)和Penicillium pimiteouiense,自QTBZ腐根分离 29 株真菌,分别鉴定为尖孢镰刀菌、腐皮镰刀菌、红贝俄式孔菌、粉红黏帚菌(Clonostachys rosea)、P.pimiteouiense、新知镰刀菌(F.andiyazi)、桃色顶孢霉(Acremonium persicinum),其中腐皮镰刀菌的分离频率在两种植区均为最高,尖孢镰刀菌次之.回接实验确定腐皮镰刀菌、尖孢镰刀菌、新知镰刀菌和立枯丝核菌是'宁杞 5 号'枸杞根腐病的病原菌,其中新知镰刀菌为新发现的枸杞根腐病病原菌.[结论]'宁杞 5 号'根腐病发生主要与根表真菌群落结构改变以及病原菌种类密切相关,与种植区关系不大,F.solani、F.oxysporum、F.andiyazi和R.solani是'宁杞 5 号'根腐病的病原菌.

    枸杞根表真菌群落根腐病病原菌分离鉴定

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    多粘类芽胞杆菌新菌株X-11及其对番茄和水稻的促生效应

    刘文志贺丹李鹏傅应林...
    249-259页
    查看更多>>摘要：[目的]从小麦(Triticum aestivum L)根际筛选到了一株细菌菌株(编号X-11),为该菌株在植物促生上应用提供依据.[方法]结合形态特征、生理生化特性、16S rDNA序列及基因组测序对其进行了鉴定,并测定其对番茄(Solanum lycopersicum)和水稻(Oryza sativa)的促生效应.[结果]该菌株菌落圆形、半透明、凸起、黏稠;菌体杆状,形成芽胞,革兰氏阴性;具有固氮,还原硝酸盐,产吲哚、分泌铁载体及分解有机磷的功能.基于 16S rDNA序列比对将X-11 菌株归类为多粘类芽胞杆菌种群,基于非冗余蛋白数据库的基因比对表明其与最近缘菌株基因相似率 55.7%,证明其为一个新菌株.X-11 菌液浸种显著增加了番茄发芽率和胚根伸长度,灌根(R)及灌根结合叶面喷施(R+L)显著提高了番茄叶片中过氧化物酶(POD)活性,R+L处理使超氧化物歧化酶(SOD)活性提高了 34.58%.水稻 1 叶 1 心期施用X-11 菌液,根长增加了 6.8%;立针期或 1 叶 1 心期施用X-11 菌液,使秧苗SOD活性分别提高了 90.4%和 51.8%.[结论]X-11 被鉴定为多粘类芽胞杆菌新菌株,是多种功能的植物根际促生菌,在植物促生方面具有开发应用潜力.

    多粘类芽胞杆菌植物根际促生菌番茄水稻

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    苏云金芽胞杆菌4BM1菌株对油菜菌核病的防治潜力

    王美玲耿丽丽房瑜束长龙...
    260-269页
    查看更多>>摘要：[目的]前期研究显示苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)4BM1 菌株可诱导油菜产生对核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)的系统抗病性.探究其诱导系统抗性机制并分析其生防潜力,为油菜菌核病的生物防治提供菌株资源.[方法]采用实时荧光定量PCR和转录组测序技术分析根部施用 4BM1 菌株后,油菜叶片中防御相关基因的转录水平;结合 4BM1 菌株全基因组序列和antiSMASH 2.0 软件预测其抗病相关次级代谢产物生物合成的基因簇;采用发酵液灌根的方式将 4BM1 菌株接种至油菜盆栽幼苗,分析其定殖能力和促生效果.[结果]4BM1 菌株可激发油菜叶片产生过敏反应;油菜根部施用 4BM1 菌株,叶片中参与水杨酸、茉莉酸、乙烯信号和油菜素内酯生物合成途径等基因转录水平显著上调;4BM1 菌株的染色体上预测到胞外多糖和其他13 个抗病相关次级代谢产物合成的基因簇;4BM1 菌株在油菜根际定殖的同时可促进油菜苗期植株的生长.[结论]4BM1 菌株可作为防控油菜菌核病、促进油菜幼苗生长有潜力的生物防治资源.

    苏云金芽胞杆菌油菜菌核病诱导系统抗性生物防治

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    复配菌群降解煤产甲烷的宏基因组与宏转录组分析

    刘丁瑞郭红光弓凯仪
    270-281页
    查看更多>>摘要：[目的]芳香化合物代谢是微生物降解煤产甲烷的限制因素.为了提高煤的生物甲烷产量,经过富集、驯化获得煤降解产甲烷菌群(RI)和菲降解功能菌群,并通过二者配伍获得复配菌群(CM).[方法]采用宏基因组与宏转录组相结合方法分析CM与RI的菌群结构及代谢途径的异同.[结果]复配后菌群的甲烷产量明显提高,增产 114.55%.复配显著提高了芳香化合物降解菌的占比,如Pseudomonas的占比高达 63.49%;同时提高了优势菌的代谢活性以及芳香化合物代谢途径中各关键酶的合成和表达.CM中芳香族化合物降解途径的基因丰度是RI的 1.65 倍,基因表达丰度是RI的 6.34 倍(P<0.05).其中,关键酶EC:1.13.11.2 基因丰度和表达丰度分别是RI的 2.24、62 倍.这些酶表达丰度的增加促使更多的芳香族化合物代谢为丙酮酸.复配同时增强了丙酮酸代谢为乙酰辅酶A过程的基因表达,该代谢途径中关键酶EC:1.2.4.1 的表达丰度在CM中可达到RI的 14.70 倍.CM中各产甲烷途径的基因表达丰度也高于RI,是RI的 2.66-7.10 倍.[结论]复配富集了芳香化合物降解菌,并显著提高了芳香化合物降解产甲烷整个代谢途径中基因丰度,尤其是基因表达丰度,从而提高甲烷产量.

    煤层气复配菌群芳香族化合物宏基因宏转录

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    RNA m1A和m5C甲基化修饰在拟轮枝镰孢伏马毒素生物合成中的作用

    侯智涵郝楠李佳琪赵斌...
    282-290页
    查看更多>>摘要：[目的]拟轮枝镰孢(Fusarium verticillioides)是一种危害严重的植物病原真菌,极大降低了粮食产量,还产生 2B类致癌物伏马毒素,威胁人畜健康.探究RNA甲基化修饰与伏马毒素之间的联系,解析RNA修饰甲基化转移酶在伏马毒素合成中的作用.[方法]利用HPLC检测了不同地区的拟轮枝镰孢菌株的伏马毒素合成能力,采用QuEChERS前处理结合超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)技术建立了m6A、mlA、m5C、Gm、m7G和Um等 6 种RNA甲基化修饰检测方法,继而对不同产毒菌株的RNA甲基化修饰进行了检测,并采用生物信息学和RT-qPCR方法确定了与伏马毒素合成相关的RNA甲基化修饰基因.[结果]不同地区的拟轮枝镰孢菌株伏马毒素合成能力具有显著差异,成功建立了RNA甲基化修饰检测方法,并确定mlA和m5C RNA甲基化修饰与伏马毒素合成负相关,RT-qPCR发现Fvalyref基因负调控伏马毒素生物合成.[结论]RNA m5C甲基化修饰与伏马毒素生物合成呈负相关且其Reader基因Fvalyref负调控伏马毒素生物合成.

    拟轮枝镰孢RNA甲基化修饰检测伏马毒素

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    嗜热毁丝霉果胶酯酶MtCE12-1的克隆表达及其酶学性质和应用研究

    张曼玉董嘉诚苟福凡弓朝晖...
    291-300页
    查看更多>>摘要：[目的]挖潜新型果胶酯酶的酶资源,在嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)中高水平表达烟草生物质诱导显著上调的同源果胶酯酶,对其进行酶学性质研究,并探究该果胶酯酶在协同降解烟草生物质过程中的作用.[方法]利用RT-qPCR的方法分析嗜热毁丝霉在烟草生物质中果胶酯酶MtCE12-1 的表达水平,通过 2A肽介导的表达筛选系统,在嗜热毁丝霉菌株ATCC 42462 中高表达果胶酯酶基因Mtce12-1,对高活性的阳性转化子进行产酶培养和蛋白纯化,表征了果胶酯酶MtCE12-1 的酶学性质;以两种烟草生物质烟草压棒和烟草梗丝为底物,通过检测纤维素的剩余含量,分析了与纤维素酶的协同作用效果.[结果]与葡萄糖培养条件相比较,烟草生物质条件下果胶酯酶基因Mtce12-1 的转录水平显著上调 109-110 倍,SDS-PAGE电泳分析、拷贝数和Western检测显示,重组蛋白MtCE12-1 成功进行了表达和分泌,表达水平达到 464.08 U/mL.该酶在 75℃、pH 8.0 时表现出最佳酶活力,在 50-85℃和pH 7.0-9.0 的范围内表现出较好的酶活力,具有良好的热稳定性.将 100-300 μg的MtCE12-1 添加至降解体系后,烟草生物质中纤维素降解效率分别提高了 18.5%-30.7%和 14.6%-30.5%.[结论]用 2A肽介导的表达系统在嗜热毁丝霉中可以高效表达和纯化制备目标蛋白,碱性果胶酯酶MtCE12-1 不仅具有良好的温度稳定性,在烟草生物质降解过程中也具有突出的作用效果,为烟草工业生产应用提供了潜在的优质酶资源.

    嗜热毁丝霉果胶酯酶基因表达酶学性质烟草生物质

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