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中国农业科学
中国农业科学院
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路文如

半月刊

0578-1752

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010-82109808 82106279

100081

北京中关村南大街12号

中国农业科学/Journal Scientia Agricultura SinicaCSCD北大核心CSTPCD
查看更多>>本刊为综合性农牧业科学学术刊物。主要发表我国农牧业科学在基础理论和应用技术方面的学术论文、重要科研成果和专题报告及各学科研究进展综述等。主要栏目有作物栽培的理论与实践、作物育种与品种资源、生物技术、植保、土肥、畜牧、兽医、研究简报等。读者对象为农牧业科技工作者、农业院校师生和农业管理干部。
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    189份桃种质肉质性状形成相关位点基因型鉴定及组合分析

    王朝晖李勇曹珂朱更瑞...
    2367-2379页
    查看更多>>摘要：[目的]通过分子标记与生物信息学手段,鉴定189份桃种质与肉质形成相关的F-M基因座、YUC11启动子区转座子插入、NAC72编码区9 bp插入的基因型及3个位点组合情况,为深入研究桃果实肉质形成机制及育种亲本选配提供理论基础.[方法]通过PCR扩增、竞争性等位基因特异PCR(kompetitive allele specific PCR,KASP)、高分辨率溶解曲线(high resolution melting analysis,HRM)技术,对F-M基因座倍型、YUC11转座子插入、NAC72 9 bp插入进行检测;同时结合重测序数据利用生物信息学方法进一步验证,从而准确鉴定189份桃种质肉质性状形成相关位点基因型及组合情况.[结果]F-M基因座编码多聚半乳糖醛酸酶(endo-PG)的PGM与PGF是调控桃果实肉质形成的两个重要基因.189份桃种质中,PGM与PGF分别有159份(84％)、99份(52％).F-M基因座共发现H0、H1、H2、H3 4种单倍型,占比分别为33％、39％、4％、24％.在F-M基因座,不溶质粘核以H13H3、H2H3组合为主,溶质粘核以H0H0、H0H1组合为主,溶质离核以H1H1、H0H1组合为主.发现18份含有硬质基因型的种质,在YUC11启动子区含有转座子纯合插入.HRM结果表明,NAC72编码区9 bp插入纯合(早熟)有45份种质、插入杂合(中熟)有71份种质、无插入(晚熟)有73份种质,中熟与晚熟种质占比77％;其中6份种质基因型与表型差别较大.不溶质粘核、溶质粘核、溶质离核3种常见肉质类型,在3个位点最多的基因型组合分别是mmffHdHdI、MMffHdHdI、MMFFHdHdL.[结论]通过分子试验与生物信息学相结合进一步证实了 F-M基因座存在4种单倍型;发现18份含有硬质基因型的种质;开发了一种用于鉴定桃成熟期的分子标记;鉴定出不同种质在肉质相关位点的基因型组合形式.

    桃肉质基因型鉴定基因型组合

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    黑曲霉改性葛渣膳食纤维的工艺优化及其理化功能特性

    符慧珍邓梅张名位贾栩超...
    2380-2394页
    查看更多>>摘要：[目的]筛选适宜粉葛渣膳食纤维(dietary fiber,DF)改性的微生物种类,优化建立其最佳改性条件,分析改性前后葛渣DF结构和理化功能特性差异,为粉葛加工副产物的综合利用提供理论依据和技术支撑.[方法]比较黑曲霉、米根霉、绿色木霉和枯草芽孢杆菌发酵对葛渣可溶性DF(so1uble dietary fiber,SDF)得率的影响,确定最佳发酵菌种;以料液比、接种量、发酵时间、发酵温度和pH为条件进行单因素试验,以SDF得率为考察指标,通过Box-Benhnken中心组合试验设计优化葛渣DF的最佳改性工艺条件;通过酶解法从发酵改性前后的葛渣中提取不溶性DF(insoluble dietary fiber,IDF)和SDF,利用扫描电镜观察其微观结构,对比分析葛渣发酵改性对其IDF理化(持水力、持油力和溶胀力)和功能特性(葡萄糖、胆酸盐和胆固醇吸附能力)的影响.[结果]黑曲霉、米根霉和绿色木霉发酵葛渣均能不同程度地增加葛渣中SDF得率,其中黑曲霉效果最好,而枯草芽孢杆菌发酵对葛渣中SDF得率无显著影响.因此,本研究选定黑曲霉为葛渣DF微生物改性菌种.通过响应面优化确定黑曲霉最佳发酵条件为料液比1∶5.8(m/v)、接种量4.9％(v/v)、发酵时间100h、发酵温度24.9℃,在该条件下SDF得率由发酵前的6.34％增加到13.75％,IDF/SDF的比例由6.14下降至2.83.与发酵前相比,黑曲霉发酵后葛渣IDF和SDF呈现更为疏松多孔的微观结构.发酵后葛渣IDF的持水力和溶胀力均是发酵前的1.2倍,但持油力无显著变化.此外,发酵后葛渣IDF的葡萄糖吸附能力是发酵前的1.70倍,胆固醇吸附能力在pH 2.0和pH 7.0条件下分别是发酵前的1.44倍和1.28倍.[结论]4种受试菌株中,黑曲霉促进葛渣IDF转化为SDF的作用最显著,以SDF得率为指标优化建立了黑曲霉发酵改性葛渣DF的最佳工艺;发酵后葛渣SDF得率提高2.17倍,IDF的理化和功能特性均得到改善.

    葛渣黑曲霉不溶性膳食纤维可溶性膳食纤维理化功能特性

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    热应激对奶牛GNAS启动子区DNA甲基化水平的影响

    陈玉梅张聪聪胡丽蓉房浩...
    2395-2406页
    查看更多>>摘要：[目的]热应激严重影响奶牛的生产和健康,是制约奶业持续健康发展的重要因素.DNA甲基化作为一种重要的表观遗传调控机制参与动物的热应激反应,但其在奶牛热应激过程中的作用和分子机制研究较少.研究通过检测奶牛热应激相关的DNA甲基化变化,筛选和验证DNA甲基化相关的关键基因,为奶牛热应激的表观遗传机制研究积累数据.[方法]以北京市三元绿荷金银岛牧场的24头中国荷斯坦牛(泌乳阶段及胎次相同)为研究对象,分别于春季(非应激期,2017年4月份)和夏季(热应激期,2017年7月份)采集试验个体的血液,提取DNA,共获得48份DNA样本.首先,随机选择其中15头奶牛,并随机分为3组,每组5份DNA样本混合,通过全基因组重亚硫酸盐测序法(Whole-genome bisulfite sequencing,WGBS)检测奶牛基因组DNA的甲基化状态,筛选差异甲基化区域(Differential methylation region,DMR;1000 bp windows,500 bp overlap,P＜0.05)及相关基因,利用 PROMO 和 Methprimer软件预测基因启动子的转录因子结合位点和CpG岛区.然后,39 ℃热处理牛乳腺上皮细胞(Bovine mammary gland epithelial cells,Mac-T)不同时间(24 h,48 h,72 h),MTT法检测细胞活力.最后,利用亚硫酸盐测序法(Bisulfite sequencing PCR,BSP)分别对春夏季的24头奶牛及39 ℃热处理不同时间的Mac-T细胞中目的基因启动子区的甲基化状态进行分析.[结果]通过WGBS共得到49 861个DMRs,其中一个DMR注释到基因GNAS复合体基因座(GNAS complex locus,GNAS)的启动子区,其整体甲基化水平在夏季热应激期极显著上调(P＜0.001),且该区域预测到一个352 bp的CpG岛,包含Sp1、C/EBP等重要转录因子的结合区域.24头奶牛个体中GNAS启动子区31个CG位点的整体甲基化水平在热应激期显著上调(P＜0.05),与WGBS结果一致,其中,21号(-113 bp,Chr1 3:57532733)和27号CG(-63 bp,Chr13:57532683)位点甲基化水平显著上调(P＜0.05).Mac-T细胞热处理48和72 h后,细胞活力极显著下降(P＜0.01),6NAS启动子的CG位点整体甲基化水平显著上调(P＜0.05),21号和27号CG均为显著上调的差异甲基化位点,与个体水平结果一致.[结论]热应激会引起奶牛GNAS启动子甲基化水平增加,GNAS是奶牛热应激DNA甲基化调控的潜在靶基因.

    热应激奶牛WGBSDNA甲基化GNAS基因

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    丙戊酸对双峰驼成纤维细胞重编程影响

    张启冉李宗帅马甜李怡娜...
    2407-2420页
    查看更多>>摘要：[目的]探讨提高双峰驼成纤维细胞重编程效率,减少因原癌基因引入造成致瘤风险.试验在成纤维细胞重编程过程中添加丙戊酸(valproic acid,VPA),探索小分子物质对双峰驼成纤维细胞重编程的影响,为双峰驼发病机制研究提供参考依据.[方法]采用3月龄双峰驼胎儿成纤维细胞,结合经典诱导组合OSKM(Oct4、Sox2、K1f4和c-Myc及治疗)和EGFP等5种逆转录病毒对双峰驼成纤维细胞进行重编程(OSKM组),并在第二次病毒感染后添加VPA处理7 d(OSKM+VPA组)收集细胞.利用PCR技术对所得细胞进行内、外源基因检测以证实逆转录病毒对双峰驼成纤维细胞的修饰作用,根据RNA-seq数据从VPA影响较为明显的基因中随机挑选8个基因,检验其在添加VPA前后的变化趋势是否与RNA-seq数据趋势一致,以验证RNA-seq数据的准确性.通过GO分析对转录组样本基因进行分类,并使用KEGG通路富集分析和超几何验证分析明确目的基因显著富集通路.对收集到的细胞进行总RNA提取并结合RNA-seq技术和实时荧光定量PCR(Real time-quantitative interpretation,RT-qPCR)技术检测VPA对双峰驼成纤维细胞重编程的影响.[结果]使用PCR技术检测内、外源基因在不同分组的表达,结果显示nSox2、Sox2、Oct4、K1f4、c-Myc在OSKM和OSKM+VPA组中均有表达,且OSKM+VPA组表达量高于OSKM组,而其在BCEFs组不表达.随机挑选8个基因检测,结果表明与细胞周期信号通路有关的TP53、CCNB1、CDC20这3个基因在添加VPA后表达量下调;与癌症表型特征相关的S100A4、CKS2、VIM、MMP9表达下调;PI3k-Akt信号通路中VEGFC表达上调;此表达趋势与组学数据趋势一致.结果显示在添加VPA后,增殖基因Mki67和PCNA表达下调,而凋亡基因CASP7表达上调.对转录组数据进行KEGG和超几何验证分析,根据分析结果筛选出959个差异表达基因,富集在276个信号通路中,其中Q值小于0.05的信号通路有八条:类固醇生物合成、细胞周期、PPAR信号通路、孕酮介导的卵母细胞成熟、脂肪酸代谢、ECM-受体相互作用、细胞黏附分子和胆固醇代谢.经筛选获得与细胞周期、脂肪酸代谢、细胞黏附分子和胆固醇代谢等相关的26个差异表达基因,并随机选取其中四个基因进行检测,结果表明:VPA可使双峰驼成纤维细胞黏附分子信号通路中L1CAM、CNTN1、NFASC三个基因表达上调,细胞间互作增强,同时上调脂肪酸信号通路中CD36基因的表达.[结论]VPA可将细胞阻滞在分裂期之前,以减少重编程过程中分化几率.同时,VPA对双峰驼成纤维细胞重编程过程中多条信号通路均具有影响,调节信号通路中相关基因表达趋势,有效提高细胞重编程效率,在双峰驼成纤维细胞重编程中发挥重要作用.

    诱导多能干细胞双峰驼丙戊酸细胞重编程

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    致马属动物流产沙门氏菌通用型间接ELISA抗体检测方法的建立与应用

    郭奎张泽楠李帅杰初晓雨...
    2421-2430页
    查看更多>>摘要：[目的]通过筛选引起马流产的4种沙门氏菌(Salmonella)共同的优势抗原,建立一种敏感高、特异强的通用型间接ELISA(iELISA)抗体检测方法,实现对马群中沙门氏菌抗体的快速高通量检测.[方法]首先利用马流产沙门氏菌阳性血清、阴性血清分别与马流产沙门氏菌全菌抗原进行免疫共沉淀(pull down)试验,筛选出马流产沙门氏菌优势抗原;根据质谱分析结果找到优势抗原基因,将优势抗原基因与其他3种致马流产沙门氏菌病的鼠伤寒沙门氏菌、都柏林沙门氏菌、肠炎沙门氏菌进行序列比对验证其保守性;其次根据抗原性分析对优势抗原编码基因进行分段表达,设计3对引物,利用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增沙门氏菌优势抗原基因并将其分别克隆至原核表达载体pET28a;测序分析后将构建正确的重组质粒分别转化入大肠杆菌(Escherichia coli E.coli)Rosetta(DE3)中并加入0.6mmol·L-1异丙基-β-D-硫代半乳糖甘(Isopropy-β-D-thiogalactoside,IPTG)进行诱导表达,观察蛋白的表达形式;蛋白纯化后通过Western blot验证蛋白的反应原性和广谱性;然后利用纯化后蛋白作为包被抗原,通过对包被抗原量、血清和第二抗体浓度等条件进行优化建立马流产沙门氏菌病间接ELISA抗体诊断方法,并对该方法的特异性、敏感性进行评估.最后将该方法应用于试验感染马血清及临床样本的检测,并将检测结果同凝集试验结果比较.[结果]筛选出的马流产沙门氏菌优势抗原是ompA(Outer Membrane Protein,OMP),通过序列比对,该蛋白氨基酸序列与同属鼠伤寒沙门氏菌、都柏林沙门氏菌、肠炎沙门氏菌同源性99.4％-100％,具有很好的保守性;PCR扩增后成功获得3条与预期符合的目的基因;成功构建了pET28a-ompA1、pET28a-ompA2、pET28a-ompA3 3 个重组质粒.SDS-PAGE 结果表明,在 24 ℃、0.6 mmol·L-1 IPTG 诱导 5 h下,含有pET28a-ompA1、pET28a-ompA2、pET28a-ompA3的重组菌均表达了相应蛋白,其中重组ompA1和ompA2蛋白以包涵体形式表达,重组ompA3蛋白以可溶性形式表达;Western blot显示,重组蛋白ompA3可与马流产沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、都柏林沙门氏菌、肠炎沙门氏菌阳性血清发生特异性反应,证明重组ompA3蛋白具有良好的反应原性,可以作为沙门氏菌属抗血清检测用抗原;以ompA3蛋白作为包被抗原建立了间接ELISA方法,在最大P/N比确定的最佳反应条件如下:最佳包被抗原浓度为1μg·mL-1,待检血清(1∶200)37 ℃作用1h,酶标抗马二抗(1∶10 000稀释),TMB在37 ℃孵育10 min,待检血清OD450＞0.143判定为阳性,特异性试验结果显示,该包被抗原与常见马传染病阳性血清无交叉反应.通过对沙门氏菌静脉注射感染马的血清样品进行抗体检测,iELISA可以持续监测抗体阳性到116 d,相比微量凝集(69 d)多监测了47 d,因此iELISA具有更好的敏感性.利用建立的iELISA方法对8个不同牧场180份血清进行抗体检测,其抗体平均阳性检出率为63.3％,比微量凝集阳性检出率高53.9％.[结论]成功筛选到了马流产沙门氏菌病4种病原的共同优势抗原ompA,实现了对该蛋白的可溶性表达,建立了马流产沙门氏菌病通用型iELISA抗体诊断方法,该方法可以实现对临床样本马流产沙门氏菌抗体的检测,该方法具有特异性强、敏感性高,可以作为马流产沙门菌病抗体检测的一种有效工具.

    马流产沙门氏菌病ompA通用型iELISA诊断

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