查看更多>>摘要:目的 基于滑膜液外泌体介导的m6A修饰,探讨牛膝醇提物对膝骨关节炎(KOA)的影响.方法 利用改良Hulth法复制KOA大鼠模型,提取并鉴定滑膜液外泌体.通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)等方法检测KOA大鼠滑膜液外泌体中m6A修饰的变化,识别差异m6A.构建滑膜炎症细胞模型,将实验分为对照组、IL-1β组、IL-1β+si-NC组、IL-1β+si-METTL3组,检测METTL3对滑膜细胞存活率及趋化因子分泌的影响.通过HE和番红固绿染色评估METTL3对KOA滑膜退变的组织学影响.使用Nanosight和RT-PCR检测牛膝醇提物对滑膜液外泌体的数量、活性及METTL3表达的影响.结果 KOA大鼠模型成功复制后,micro-CT显示对照组大鼠的膝关节表面光滑,关节间隙正常;而模型组大鼠的膝关节表面粗糙,关节间隙狭窄.通过Nanosight检测,外泌体颗粒丰度为76~80 nm,Western blotting检测结果显示,CD9和TSG101高表达,电子显微镜下外泌体为椭圆形,直径<200 nm.m6A定量检测结果显示,KOA模型组m6A总量、METTL3表达均高于对照组(P<0.05),去甲基化酶表达均无明显变化(P>0.05).METTL3沉默对滑膜细胞存活率的影响检测结果显示,与IL-1β组和IL-1β+si-NC组比较,IL-1 β+si-METTL3组的细胞存活率升高(P<0.05).检测METTL3沉默对滑膜细胞趋化因子SDF-1和MCP-1分泌的影响,结果表明,与IL-1β组和IL-1β+si-NC组比较,IL-1β+si-METTL3组SDF-1和MCP-1浓度均降低(P<0.05).HE和番红固绿染色结果显示,对照组细胞层次分明,无明显炎症浸润;模型组和Scr-RNA组细胞排列紊乱,有血管增生和炎症浸润;Sh-METTL3组炎症浸润减少,血管增生缓解.牛膝醇提物含药血清刺激实验检测滑膜细胞存活率结果显示,与模型组比较,牛膝醇提物组滑膜细胞存活率升高(P<0.05).与METTL3过表达组比较,METTL3过表达加牛膝醇提物组滑膜细胞存活率升高(P<0.05).动物实验中,与对照组比较,牛膝醇提物组外泌体数量和乙酰胆碱酯酶活性均无明显变化(P>0.05),但模型组METTL3基因相对表达量高于对照组和牛膝醇提物组(P<0.05).结论 KOA滑膜液外泌体中METTL3高表达,能够降低滑膜细胞存活率并促进趋化因子分泌.牛膝醇提物可能通过降低外泌体中METTL3的表达缓解KOA滑膜炎症.