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中国预防兽医学报
中国预防兽医学报

孔宪刚

月刊

1008-0589

zgyfsyxb@vip.sina.com.cn

0451-85935050 18946066050 18946066181

150001

哈尔滨市南岗区马端街427号

中国预防兽医学报/Journal Chinese Journal of Preventive Veterinary MedicineCSCD北大核心CSTPCD
查看更多>>本刊是由国家科技部批准，农业部主管并委托中国农业科学院哈尔滨兽医研究所主办的国家级学术刊物，双月刊，国际标准大16开本，120页。刊号ISSN1008-0589，CN23-1417/S。本刊是中国自然科学核心期刊、中国期刊网入网期刊。中国科学引文数据库来源期刊，中国学术期刊评价数据库来源期刊。国内外公开发行。本刊始终坚持社会主义办刊方向，坚持“面向、依靠、攀高峰”方针，坚持理论与实践相结合，提高与普及相结合，以提高为主的办刊方针，大力提倡学术性、科学性、实用性、创新性、及时报道国内外预防兽医学方面的新进展、新成果、积极开展学术交流，为促进我国兽医科技事业的发展和畜禽疫病水平的提高，为加速科技成果的转化做出了重大贡献。
正式出版
收录年代

    Rab5对禽偏肺病毒C型复制影响的研究

    冯旭飞亓宇翔于瀚哲张正洲...
    447-454页
    查看更多>>摘要：为探究禽偏肺病毒C型(aMPV/C)感染A549细胞后,脑内Ras类似物5(Rab5)对病毒复制的影响,本研究将重组质粒pGFP-Rab5和负显性突变的Rab5(pGFP-Rab5-DN)分别转染A549细胞,24 h后分别以MOI 1的aMPV/C感染该细胞,48 h后进行激光共聚焦显微镜观察,结果显示Rab5、Rab5-DN和aMPV/C N蛋白均分布于细胞质中,且Rab5与aMPV/C N蛋白存在明显的共定位.进一步采用Image J软件对细胞内的荧光强度分析后发现,Rab5与aMPV/C N蛋白存在多处共定位,而Rab5-DN与aMPV/C N蛋白无明显共定位,表明Rab5参与aMPV/C的复制.将pCMV-Flag-Rab5和pCMV-Flag分别转染A549细胞,24 h后分别以MOI 1的aMPV/C感染该细胞,48 h后分别收集上清和细胞样品.分别采用western blot检测Rab5及aMPV/C N蛋白的表达水平、荧光定量PCR(qPCR)检测aMPV/C N基因转录水平、TCID50 检测细胞上清的病毒效价.结果显示,与转染pCMV-Flag的细胞相比,转染pCMV-Flag-Rab5的细胞中Rab5的表达水平明显升高;此外,pCMV-Flag-Rab5转染组中的aMPV/C N蛋白表达水平和N基因的转录水平均极显著升高(P<0.01),病毒效价显著升高(P<0.05).表明,过表达Rab5促进aMPV/C的复制.将siRab5和siNC分别转染A549细胞,24 h后分别以MOI 1的aMPV/C感染该细胞,48 h后分别收集上清和细胞样品.分别采用western blot检测Rab5及aMPV/C N蛋白的表达水平、qPCR检测aMPV/C N基因的转录水平、TCID50检测细胞上清的病毒效价.结果显示,与转染siNC的细胞相比,转染siRab5的细胞中Rab5的表达水平明显降低;同时,siRab5转染组中aMPV/C N蛋白的表达水平和N基因的转录水平均极显著降低(P<0.01),病毒效价显著降低(P<0.05).表明,干扰Rab5表达可抑制aMPV/C 的复制.将pCMV-mcherry-Rab5与表达融合GFP的aMPV/C结构蛋白的重组质粒分别转染A549细胞,24 h后采用激光共聚焦显微镜观察发现Rab5蛋白与aMPV/C N、F、M、G、SH、P、M2-1、M2-2、L1、L2、L3蛋白均在细胞质中存在荧光信号重叠,但该蛋白与L4蛋白无该现象,表明Rab5蛋白可与多个aMPV/C 蛋白共定位.将pCMV-Flag-Rab5分别与表达融合GFP的aMPV/C结构蛋白的重组质粒共转染HEK293T细胞,48 h后采用Co-IP试验检测Rab5与不同aMPV/C 结构蛋白的相互作用.结果显示,IP样品中表达G和L2蛋白的位置出现了特异性条带,而其他蛋白无条带,表明Rab5与aMPV/C G和L2蛋白存在互作.上述结果首次证实,Rab5通过与aMPV/C多个蛋白(G和L2)的互作参与aMPV/C的复制机制.本研究为阐明Rab5调控aMPV/C复制的分子机理提供研究借鉴.

    脑内Ras类似物5禽偏肺病毒C型复制表达水平互作

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    鸡滑液囊支原体ZP-1株的分离鉴定及其致病性和免疫保护效果的评估

    李真亚孔嫄嫄杨红玉李允...
    455-460页
    查看更多>>摘要：为分离鉴定鸡滑液囊支原体(MS),并评估其致病性和免疫保护效果,本实验无菌采集南阳市多家鸡场35份疑似MS发病鸡的关节腔粘液和关节组织,通过病原分离培养后观察菌落、PCR鉴定并测序.结果显示,在改良Friis固体培养基上可见圆形、边缘整齐、隆起的"煎蛋样"菌落形态;PCR可以扩增到16S rRNA基因目的条带,扩增产物测序后与NCBI中登录的ATCC 25204标准菌株16S rRNA基因序列比对,结果显示二者的同源性达99%以上,本实验共分离到5株MS.选择ZP-1株进行生物学特性研究,通过颜色变化单位(CCU)试验测定其生长滴度、采用试剂盒测定其代谢产生的H2O2水平.结果显示,在培养24 h～36 h后,ZP-1株的生长滴度最高可达1012 CCU/mL,具有生长速度快、滴度高的特点.在甘油存在的情况下,ZP-1株产生H2O2的相对水平极显著高于弱毒疫苗株(P<0.001).将ZP-1株分别通过足垫和静脉注射感染SPF鸡,评估其致病性;利用该菌株制备灭活疫苗经皮下接种鸡后攻毒,分析ZP-1株的免疫保护效果.结果显示,该分离株可复制出MS典型症状及病变;利用该菌株制备的灭活疫苗对鸡的攻毒保护率可达80%,高于商品化疫苗,其降低MS关节组织定植水平和MS抗体水平与商品化疫苗一致.本研究获得了具有较高生长滴度(1012 CCU/mL)的MS分离株ZP-1,发现利用该MS分离株制备的灭活疫苗具有较好的免疫保护效果,为MS疫苗的研发奠定了基础.

    鸡滑液囊支原体分离鉴定致病性免疫原性

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    2021年～2022年我国猪盖塔病毒流行情况调查及其E2基因序列遗传变异分析

    吴语晗董雅琴崔进张慧...
    461-467页
    查看更多>>摘要：为了解2021年～2022年我国猪盖塔病毒(GETV)的流行现状和遗传变异情况,本研究对我国16个省份采集2 512份临床样品,采用荧光定量RT-PCR方法进行GETV的检测,按照省份和地区进行GETV流行病学调查分析;采用RT-PCR方法对部分GETV阳性样品经PCR扩增E2基因并连接至pMD18-T载体并测序,利用DNAStar软件分析E2基因及其编码氨基酸序列与GETV参考株相应序列的同源性及其氨基酸变异情况;利用MEGA6.0软件构建E2基因的进化树,分析GETV的基因型及遗传进化关系.结果显示,7个省份猪群样品中均检测出GETV阳性样品,阳性率为3.34％(84/2512).其中,陕西省和黑龙江省为首次在猪中检测到GETV.不同生长阶段猪中,仔猪GETV的检出率最高,达9.52％.同源性分析显示,获得的32个猪源GETV E2基因序列之间的同源性为98.3％～100％,与马来西亚GETV MM2021株相应基因序列的同源性为94.4％～94.9％.氨基酸序列变异分析显示,与参考株相比,本研究测序的E2蛋白有9个氨基酸位点只出现于猪源GETV.遗传演化分析显示,32个GETV株均属于Ⅲ亚群,与Ⅲ亚群内早期中国M1株、韩国QIAG9301株、日本Kochi等病毒株相比,本研究鉴定的GETV形成了新的进化分支.本研究揭示了我国当前猪群中GETV的感染现状及流行株的遗传变异情况,为该病毒的分子生物学研究和相关疫病防控策略的制定提供基础数据和参考依据.

    盖塔病毒E2基因流行病学调查氨基酸变异遗传进化分析

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    2型猪链球菌天津分离株的鉴定及其遗传特征分析

    董志民李秀丽杨春蕾杨丽景...
    468-475页
    查看更多>>摘要：为了解天津市某猪场引起育肥猪神经症状的病原及其特性和遗传特征,本研究采集8份患病猪脑组织样品经细菌分离、形态学观察、gdh基因和cps2J基因的PCR扩增及序列分析,确定8份样品中的分离株均为同一2型猪链球菌(SS2),命名为TJS75.测定其生长曲线、并按照文献方法进行溶血性试验、黏附/侵入试验和对小鼠的致病性试验,分析该SS2分离株特性.结果显示,TJS75菌株经TSB培养6 h～15 h可达对数生长期,对绵羊血红细胞(RBC)具有崩解效果,可黏附并侵入PK-15细胞(黏附率和侵袭率分别为5.16%和7.90%),且感染TJS75株的BALB/c小鼠出现不同程度的行动迟缓、呼吸急促、精神萎靡和神经症状等,经测定其LD50为2.15×107 cfu/mL.进一步采用高通量测序,并预测其毒力基因,分析该菌株的遗传特征,结果显示,TJS75菌株基因组全长2 368 195 bp,GC含量40.88%,含有2 299个编码基因,其中有1 822、1 830和1 077个基因分别注释于GO、COG和KEGG数据库,携带的16S rRNA基因序列与国内分离的SS强毒株98HAH33和05ZYH33的亲缘性较近,毒力基因的预测结果显示该菌株携带499种毒力相关基因(编码173种毒力相关因子),依据功能分类,这些毒力基因参与SS2的黏附和侵袭、溶血、促进铁转运、自溶酶的合成、降解胶原酶、唾液酸的合成等.本研究首次分离到携带MRP毒力因子的ST25型SS2,为深入开展SS2 TJS75株的致病机制研究提供了科学依据.

    猪链球菌2型分离鉴定致病力遗传特征

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    内蒙古牛呼吸道合胞体病毒的分离鉴定及其全基因组分析

    黄金田李静丁玉林王文龙...
    476-483页
    查看更多>>摘要：为确定引起内蒙古地区3月龄～6月龄荷斯坦犊牛暴发呼吸系统疾病的病原,并分析其基因组序列,本研究对病死犊牛剖检并观察其各脏器的剖检病变,制备各组织病理切片,观察其组织病变.结果可见犊牛肺脏呈深红色有光泽的肌肉样实变,心脏肥大,肝脏表面散在细小的结节状灰白色病灶,肾脏表面散在细小深红色出血点;组织病理学观察可见典型间质性肺炎,多数各级细支气管腔和肺泡腔内巨噬细胞和淋巴细胞大量增生和浸润,偶见合胞体细胞,在各级细支气管部分黏膜上皮细胞浆内有大小不等的圆形红染的病毒包涵体;轻度纤维化和小坏死灶的变质性肝炎,急性炎性脾肿,多发性小出血灶的慢性硬化性肾小球肾炎.进一步进行RT-PCR检测,结果显示,扩增获得约600 bp的目的条带,测序后与GenBank中相关基因序列比对,结果显示目的基因与牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)美国分离株USII/S1(KU159366)的同源性最高(98.42%),表明该地区某牧场犊牛感染了BRSV.将该病例肺组织研磨上清液接种牛肾细胞(MDBK)盲传3代出现典型的细胞病变,经RT-PCR检测确认为BRSV,进一步表明分离到1株BRSV,命名为IM BRSV-39.分段扩增IM BRSV-39株的全基因组序列,经测序后拼接获得长度为15 130 bp的BRSV全基因组序列.采用MegAlign软件分析IM BRSV-39株的全基因组序列、G基因序列和F基因序列的同源性及突变位点;采用MEGA 11软件构建分离株全基因组进化树分析其遗传进化关系.结果显示,IM BRSV-39株的全基因组序列、G基因和F基因序列均与BRSV Ⅲ亚型分离株相应基因序列的同源性最高、且位于同一进化分支,证实IM BRSV-39株属于BRSV Ⅲ亚型;突变位点分析结果显示:与BRSV Ⅲ亚型参考株相比,IM BRSV-39株G基因序列存在7个突变位点,F基因序列存在12个突变位点;G蛋白氨基酸序列存在4个突变位点,其中L13H处在G蛋白的胞质结构域(aa1～aa37);Y127H、I139T、P177L、A186T处在G蛋白的胞外结构域(aa66～aa257);F蛋白氨基酸序列存在5个氨基酸突变位点,其中M4T、M7T、S14C处在F蛋白氨基末端信号肽区(aa1～aa26).本研究检测并分离到1株BSRV,揭示了该病毒基因组的遗传进化特征,为国内BRSV的深入研究奠定了基础.

    病毒包涵体牛呼吸道合胞体病毒全基因组遗传进化

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    新疆阿克苏地区羊源耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的分离鉴定及毒力基因与耐药性分析

    王笑笑马小娟胡嘉莘李建龙...
    484-491页
    查看更多>>摘要：近年来在家畜体内及动物性食品中多次检测到耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA),该菌对人和动物健康造成严重威胁.为了解新疆阿克苏地区患呼吸道疾病羊携带的病原菌,本研究从阿克苏6个规模化羊场共采集280份(136份病羊和144份健康羊)鼻拭子样品,分别划线接种于BHI脱纤维绵羊血平板和高盐甘露醇琼脂平板,并对分离菌经革兰氏染色镜检和生化鉴定.结果显示,初步从136份病羊和144份健康羊鼻拭子样品中分别分离到34株及62株共计96株金黄色葡萄球菌(SA).通过PCR分别扩增SA的nuc基因及MRSA的mecA基因,结果进一步显示分离到96株SA,其中24株(25%)为MRSA,且均为从患病羊中分离.通过PCR检测MRSA的6种常见毒力基因.结果显示,24株MRSA中clfa、hla及pvl的检出率均为100.0%,tst、fnbB和sec的检出率分别为41.2%(10/24)、45.7%(11/24)和33.6%(8/24).将24株MRSA分别以104 cfu/mL～108 cfu/mL感染小鼠,通过观察各组小鼠的临床症状统计死亡率,观察死亡小鼠脏器的剖检病变,并再次从组织中分离细菌,以评估分离的MRSA对小鼠的致病性.结果显示,感染8 h后各组小鼠开始出现临床症状,108 cfu/mL和107 cfu/mL感染组小鼠在感染后不同时间全部死亡;106 cfu/mL～104 cfu/mL感染组小鼠的死亡率分别为83.3%、83.3%及33.3%;对照组小鼠72 h内全部健活.剖检可见死亡小鼠肺脏表面大面积出血,肝脏、脾脏肿大,其余脏器未见明显变化,可从死亡小鼠的肺脏中再次分离到MRSA.最终确定22株MRSA对小鼠具有致病性.采用K-B纸片法检测24株MRSA对9类15种药物的敏感性,采用PCR检测24株MRSA的耐药基因mecC、blaZ(β-内酰胺类)、ermA(大环内酯类)、Aac(6')/aph(2'')、aph(3')-Ⅲ、Ant(4')-Ia(氨基糖苷类)、qnrA(喹诺酮类)和tetM(四环素类).药敏试验结果显示,24株MRSA对β-内酰胺类的青霉素及氨曲南,头孢菌素类的氨苄西林全部耐药,其中14株MRSA为多重耐药(58.3%,14/24),主要以3重耐药菌株为主,占42.8%(6/14),其次分别为4重耐药(28.6%,4/14)、5重耐药和6重耐药(均为14.3%,2/14)的菌株.但也有部分菌株对四环素、红霉素、克林霉素和环丙沙星敏感.耐药基因检测结果显示,24株MRSA中检测到6种耐药基因,其中mecC、blaZ的检出率达100%;tetM的检出率为79.2%(19/24);ermA的检出率为37.5%(9/24);Aac(6')/aph(2'')、aph(3')-Ⅲ、Ant(4')-Ia的检出率均为25.0%(6/24),且这些MRSA携带3～6种耐药基因.通过实验结果分析24株MRSA的耐药表型与耐药基因之间均呈正相关,且未检测到喹诺酮类耐药基因qnrA,与MRSA对该类药物环丙沙星敏感的结果也一致.本研究在新疆阿克苏地区患呼吸道疾病的羊中分离的MRSA携带多种毒力基因,对小鼠的致病性均较强,且对多种药物耐药并携带多种耐药基因,可能与羊患呼吸道疾病有关.本研究为新疆阿克苏地区羊呼吸道疾病病原学的研究和临床用药提供参考.

    羊呼吸道耐甲氧西林金黄色葡萄球菌毒力基因致病性耐药性

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    河南地区兔源克雷伯氏菌耐药性及耐药基因的分析

    牛冰玉刘玉梅崔晶晶王晴晴...
    492-498页
    查看更多>>摘要：为了解河南地区兔源克雷伯氏菌的生物学特性、携带的耐药基因及耐药基因与耐药表型之间的相关性,本研究于2022年3月～2023年4月从河南省7个不同地区规模化养兔场共采集74份具有典型克雷伯氏菌病临床症状兔的病料样品,分别划线接种于LB固体培养板和血琼脂培养板进行病原菌的分离培养.通过菌落形态观察、革兰染色镜检、生化试验、PCR扩增克雷伯氏菌Khe基因并经BLAST比对和构建Khe基因的进化树确定细菌的种类.结果显示,从74份兔病料样品中共分离到10株克雷伯氏菌,且该10株菌主要集中在洛阳(3/10)和周口(2/10),开封、郑州、漯河、济源及新乡各分离到1株.分别通过K-B法和PCR对不同地区来源的菌株进行3类共8种药物的药敏试验和上述药物的相关耐药基因检测,采用SPSS 26软件分析耐药表型与耐药基因之间的相关性.结果显示,对新霉素、庆大霉素、卡那霉素(氨基糖苷类),环丙沙星、诺氟沙星(喹诺酮类),四环素(四环素类)6种药物耐药的菌株占80％～100％,对氧氟沙星(喹诺酮类)和多西环素(四环素类)耐药的菌株占60％～70％,且多重耐药菌株占90％,并以耐庆大霉素和环丙沙星药物为主.对上述3类药物平均耐药菌株的占比分别为90％、80％和80％.从洛阳、开封和郑州地区分离的菌株耐药严重,对8种药物均耐药,呈严重的多重耐药性;周口和新乡地区分离的菌株耐药性虽相对较弱,但也呈多重耐药性.耐药基因的PCR结果显示,aac(6')-Ib、ant(3'')-I和aph(3'')-I(氨基糖苷类)、Aac6和qEpA(喹诺酮类)、tetQ(四环素类)的检测率均高达60％以上,qnrs(喹诺酮类)的检测率为30％,未检出tetO(四环素类).从洛阳分离的菌株携带耐药基因的数量和种类最多,从周口和郑州分离的菌株携带耐药基因的数量和种类较少,从开封、漯河、济源和新乡分离的菌株携带耐药基因的数量相同,但携带耐药基因的种类不同.经计算分析,10株菌对氨基糖苷类和喹诺酮类药物的耐药表型及其耐药基因之间基本呈正相关(符合率分别为81.4％和70.9％),四环素类耐药表型和耐药基因的符合率较低仅为37.5％,但分离菌对四环素类药物呈一定的耐药性.综上表明,河南地区兔源克雷伯氏菌的耐药性严重,且多呈多重耐药性,耐药基因较复杂多样.本研究首次检测了河南地区兔源克雷伯氏菌的耐药表型与耐药基因并分析它们之间的相关性,为河南地区兔场克雷伯氏菌病的防治提供参考依据.

    克雷伯氏菌兔耐药性耐药表型耐药基因

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    猪急性腹泻综合征冠状病毒S蛋白多克隆抗体的制备及在检测该病毒感染中的应用

    刘大凯韩郁茹张记宇张燎原...
    499-504页
    查看更多>>摘要：为制备猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)纤突蛋白(S)的多克隆抗体(PAb),本研究经PCR扩增SADS-CoV S蛋白S1亚基C端结构域(S1-CTD)基因片段(384 bp),并将其克隆至原核表达载体pGEX-6p-1中,构建重组质粒pGEX-6p-1-S1-CTD,经双酶切和测序鉴定正确后,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,利用IPTG诱导表达,通过western blot鉴定重组S1-CTD蛋白(rS1-CTD)的表达及反应原性.结果显示,rS1-CTD以包涵体的形式表达,在40 ku处出现特异性条带.诱导表达后的rS1-CTD经不同浓度尿素重悬并超声离心,SDS-PAGE检测后切胶纯化,得到纯化的重组蛋白.利用BCA试剂盒测得蛋白的浓度为33 μg/mL.将该重组蛋白乳化后经3次免疫新西兰大白兔,并在3免一周后采血,分离血清获得S1-CTD蛋白PAb.将SADS-CoV感染Vero E6细胞24 h后,以获得的兔PAb为一抗,分别采用western blot和间接免疫荧光试验(IFA)检测该PAb的反应原性.Western blot结果显示,在约250 ku处出现特异性条带,而阴性对照组无该条带;IFA结果显示,SADS-CoV感染的细胞中出现绿色荧光,而阴性对照细胞无绿色荧光.将SADS-CoV感染仔猪的回肠组织制备病理切片,以制备的PAb为一抗,通过免疫组织化学(IHC)检测SADS-CoV的抗原.结果显示,该组织切片中出现棕色阳性信号,而阴性对照仔猪回肠组织切片则无该棕色信号.表明该PAb可与感染SADS-CoV的仔猪回肠组织中的相应抗原发生特异性免疫反应.综上所述,本实验制备的S1-CTD蛋白PAb具有良好的反应原性和免疫原性,可以用于western blot、IFA、IHC检测体内外SADS-CoV的感染,为后续SADS-CoV检测方法的建立及S蛋白生物学功能的研究奠定基础.

    猪急性腹泻综合征冠状病毒S蛋白原核表达多克隆抗体初步应用

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    快速检测十足目虹彩病毒1 RPA-LFD方法的建立及初步应用

    袁雪梅陈静黄雷蔺凌云...
    505-510页
    查看更多>>摘要：为建立一种高效、快速、简便的十足目虹彩病毒1(DIV1)检测方法,本研究以DIV1 ATPase基因为检测靶标,设计特异性引物和探针,采用方阵法优化反应温度和时间,结果显示,重组酶聚合酶扩增技术(RPA)最优反应温度为37℃,时间为15 min,结果观察时间为5 min,检测过程总时长为20 min,初步建立了DIV1的重组酶聚合酶扩增技术结合侧向流试纸条方法(RPA-LFD).提取其他7种常见虾类病原基因组与DIV1基因组,采用该方法检测,分析其特异性;构建重组质粒标准品pUC57-DIV1,10倍倍比稀释后采用该方法检测,分析其灵敏性;以3种不同浓度的重组质粒标准品为模板进行批间、批内重复性试验.结果显示,该方法能特异性检测DIV1,与虾类其他常见易感病原均无交叉反应;其对重组质粒标准品的检测限为1×101拷贝/μL;批内和批间重复性试验的检测结果均一致,重复性好.利用该方法与已发表的荧光定量PCR(qPCR)同时检测15份感染DIV1的罗氏沼虾样品及40份临床样品,结果显示,该方法的阳性检测率为69.09%(38/55),阴性率为30.91%(17/55),与qPCR检测结果一致,二者的阳性符合率、阴性符合率、总符合率均为100%.综上所述,本研究建立的RPA-LFD方法检测DIV1具有快速、简便、灵敏度高且特异性强的特点,且不需要精密昂贵的仪器设备,为基层实验室及现场检测提供了可行技术手段.

    重组酶聚合酶扩增侧向流试纸条技术十足目虹彩病毒Ⅰ

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    2.1亚型猪瘟病毒流行株E2蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定

    张艺潇吴梦米士江刘钟迪...
    511-521页
    查看更多>>摘要：为获得仅与我国基因2.1亚型猪瘟病毒(CSFV)流行株反应的单克隆抗体(MAb),并揭示疫苗株与流行株E2蛋白抗原氨基酸的差异,本研究利用基因2.1亚型重组质粒pFastBac1-JL23 E2通过杆状病毒表达重组E2蛋白(rE2),并采用Ni柱纯化后经SDS-PAGE检测rE2的表达及纯化效果;采用western blot鉴定rE2的反应原性.SDS-PAGE及western blot结果表明经杆状病毒表达了基因2.1亚型CSFV E2蛋白,且其纯化效果和反应原性均较好.采用杂交瘤技术制备2.1基因亚型CSFV E2蛋白的单克隆抗体(MAb),采用亲和层析法纯化该MAb,采用BCA法测定其浓度及亚类.将79株1.1、2.1、2.2和2.3基因亚型的CSFV及1.1基因亚型的HCLV株和SM株感染PK-15细胞,72 h后采用IFA检测MAb与不同基因型CSFV的反应性;采用western blot鉴定MAb与10个基因亚型共18种CSFV代表株E2蛋白的反应性.采用IFA鉴定MAb与不同基因型CSFV的中和活性.结果显示,经IFA筛选后共获得16株分泌E2蛋白MAb的杂交瘤细胞株.其中仅一株MAb TCH061与所有2.1基因亚型(2.1a、2.1b、2.1c、2.1g、2.1h、2.1i、2.1j、2.1k、2.1l、2.1m、2.1n)CSFV感染的细胞反应后出现绿色荧光,与基因1.1亚型HCLV疫苗株和SM株以及其他基因型CSFV感染的细胞反应后均无绿色荧光;western blot结果显示,该MAb能够识别2.1基因亚型CSFV E2蛋白(2.1a、2.1b、2.1c、2.1g、2.1h、2.1i、2.1j),在90 ku处出现特异性条带,而与其他基因型CSFV E2蛋白均不反应.表明TCH061为2.1基因亚型CSFV E2蛋白特异性的MAb.MAb的纯化结果显示,在50 ku和25 ku处有明显条带,其浓度为1.70 μg/μL且该 MAb TCH061重链为IgG2a,轻链为κ链.中和活性结果显示,TCH061对JL23株(2.1b)、GDLF1株(2.1c)有一定的中和活性,但不能中和C株.分别以GD53株E2 4个不同区域的截短蛋白为抗原通过western blot初步确定MAb识别抗原表位的区域.利用CLC Sequence Viewer比对与MAb反应的CSFV E2蛋白氨基酸序列的差异,通过SWISS-MODEL预测MAb抗原表位的关键氨基酸位点.利用杆状病毒表达CSFV JL23株各位点突变后的E2蛋白,采用western blot鉴定各突变的E2蛋白与MAb TCH061的反应性.Western blot结果显示,TCH061的抗原表位位于E2蛋白的aa1～aa90,且其识别CSFV E2蛋白P20不识别L20的CSFV.通过SWISS-MODEL预测E2蛋白氨基酸序列的I18、G19、P20、L21、G22、A23和E24在空间上比较接近;MAb TCH061与JL23株I18M突变的E2蛋白反应,与G19K、P20L和L21P突变的E2蛋白均不反应,与G22K突变的E2蛋白反应性较弱,与HCLV E2蛋白不反应,但与HCLV L20P突变的E2蛋白反应.证实TCH061的抗原表位为19GPLG22,经PyMOL结构模拟确定其为空间构象表位;且除了aa20,其他位点在各基因型CSFV中均非常保守,表明P20是2.1基因亚型CSFV流行株E2蛋白抗原表位的关键氨基酸.综上所述,本研究首次获得一株区别于CSFV疫苗株和2.1基因亚型CSFV流行株的MAb TCH061,揭示了疫苗株与流行株E2蛋白氨基酸位点的差异,为研发猪瘟疫苗和CSFV流行株感染的血清学鉴别检测方法的建立提供了重要的MAb资源.

    猪瘟病毒单克隆抗体病毒反应性抗原表位

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