查看更多>>摘要：目的 探索人脐血浆源血小板裂解物(UCB-PL)制备工艺,并形成无肝素以及无动物源性成分的脐带间充质干细胞(UCMSC)培养体系.方法 脐带血浆采用离心法分离富血小板血浆(PRP),采用高速离心PRP浓缩血小板,-80℃/37℃反复冻融3次制得UCB-PL.BCA法检测UCB-PL总蛋白含量、ELISA法检测UCB-PL主要生长因子含量、UCB-PL培养基纤维蛋白原含量.自然沉降法耗竭UCB-PL培养基中纤维蛋白原,制成无肝素抗凝的UCMSC培养体系.观察培养体系下UCMSC生长形态,测定UCMSC增殖数量、细胞活率,检测UCMSC表面标志物表达情况,细胞集落形成能力,成骨、成软骨、成脂分化能力情况.结果 从脐血浆中获得血小板浓缩物,回收率为(50.68±7.28)％;按培养基体积比5％、10％ 及20％ 配制UCB-PL培养基,未经纤维蛋白原耗竭处理用于UCMSC培养,3组培养基均不同程度凝结,经纤维蛋白原耗竭处理后,培养基不再凝结,纤维蛋白原含量分别减少85.26％(P<0.01)、85.90％(P<0.01)和93.71％(P<0.01).经纤维蛋白原耗竭处理后,以20％UCB-PL培养UCMSC细胞数量最高(P<0.01),细胞活率各组间无显著差异(P>0.05);UCMSC细胞形态呈长梭状,平行或旋涡纹贴壁生长,细胞表面标志物抗原CD45+/CD34+/CD14+/CD19+阳性细胞比例为0.09％,CD73+、CD90+以及CD105+阳性细胞比例分别为98.33％、99.56％ 以及96.37％.细胞经成脂、成骨、成软骨诱导后,油红O、茜素红S及阿利新蓝染色结果表明,细胞具有三向分化能力.0.1％ 结晶紫水溶液染色表明细胞集落形成能力良好.ELISA检测UCB-PL中,碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)含量为(39.69±5.31)pg/ml,胰岛素样生长因子1(IGF-1)含量为(21.25±3.84)ng/ml,血小板源性生长因子AB(PDGF-AB)含量为(3.81±0.35)ng/ml,转化生长因子β1(TGF-β1)含量为(19.65±1.55)ng/ml.BCA试剂盒检测UCB-PL总蛋白含量为(1130.51±164.96)μg/ml.不同保存温度下UCB-PL细胞因子含量检测结果表明UCB-PL制备完成需冷冻保存,-80℃ 保存90 d时UCB-PL的IGF-1、PDGF-AB及TGF-β1含量无显著变化,bFGF含量降低极显著(P<0.01),-20℃保存90 d时bFGF、IGF-1、TGF-β1含量较保存30 d时无显著变化,PDGF-AB含量显著降低(P<0.05),4℃及室温保存30 d后细胞因子含量极显著降低(P<0.01).结论 从脐血浆中制取UCB-PL可作为胎牛血清(FBS)替代物用于UCMSC的扩增培养.制备获得的UCB-PL需冷冻保存.采用纤维蛋白耗竭方法处理UCB-PL培养基后,可形成无动物源性的抗凝培养体系.
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