查看更多>>摘要：目的 利用网络药理学方法、分子对接及体外细胞实验探究通关藤(marsdenia tenacissima,MT)口服液抑制胃癌(gastric cancer,GC)增殖的潜在作用机制.方法 通过搜索文献、检索TCMSP、Swiss Target Prediction数据库完成MT化学成分、靶点基因的收集;采用 GeneCards 数据库获取疾病相关靶点;利用 STRING 平台和 Cytoscape 软件构建交集靶点的蛋白互作网络(protein-protein interaction,PPI);采用Metascape 网络平台进行GO和KEGG信号通路分析;运用 AutoDock 对部分活性成分与潜在靶点进行分子对接验证;采用四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法检测MT口服液对GC细胞增殖的抑制作用,分别与厄洛替尼和阿帕替尼联用的协同作用、流式细胞术检测 MT 口服液诱导 GC 细胞凋亡及对胃癌细胞周期的影响;采用RT-qPCR法检测MT口服液对GC细胞周期、凋亡相关基因表达的影响;采用Western blot法验证网络药理学和分子对接筛选的靶点.结果 共得到MT主要活性成分 17 个,胃癌关键靶点1 880 个,主要信号通路 167 条.体外实验结果表明,40～200 mg/mL 的MT口服液可有效抑制GC细胞增殖(P<0.01),与厄洛替尼和与阿帕替尼联用时,具有协同效应.40～160 mg/mL的MT口服液可诱导胃癌细胞凋亡(P<0.01),阻滞细胞周期G0/G1 期(P<0.01).RT-qPCR 结果显示,通关藤口服液可以上调B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)相关X蛋白(Bcl-2-associated X protein,BAX)的表达量,下调Bcl-2、细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin dependent kinase,CDK)4、CDK6(P<0.05)的表达量.Western blot 结果显示 MT 口服液,抑制磷酸化-表皮生长因子受体(phosphorylated-epidermal growth factor receptor,p-EGFR)、磷酸化-磷脂酰肌醇-3 激酶(phosphorylated-phosphatidylinositol 3-kinase,p-PI3K)、磷酸化 AKT 丝氨酸/苏氨酸激酶(p-AKT)、磷酸化-雷帕霉素激酶的机制靶点(phosphorylated-mechanistic target of rapamycin kinase,p-mTOR)的表达水平,降低p-EGFR/EGFR、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT1、p-mTOR/mTOR比值;同时上调BAX、肿瘤蛋白p53(tumor protein p53,P53)、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(cyclin dependent kinase inhibitor 1A,CDKN1A/P21),下调Bcl-2、CDK4、CDK6(P<0.05)水平.结论 MT口服液可有效抑制胃癌细胞的增殖,阻滞细胞周期并诱导胃癌细胞凋亡,并提高小分子靶向药物厄洛替尼和阿帕替尼治疗胃癌的敏感性.其机制与经调控 PI3K/AKT/mTOR 信号通路上调 BAX、P53、P21,下调Bcl-2、CDK4、CDK6 的表达,并抑制EGFR信号通路有关,实验结果验证了网络药理学和分子对接的结果.
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