查看更多>>摘要：目的 构建双层含骨基质骨器官芯片并用于体外模拟成骨细胞和破骨细胞分化,为抗骨质疏松药物开发提供新平台.方法 使用WorkSoild软件制作双层双通道骨器官芯片设计图,利用光刻技术制备浇注母版.以聚二甲基硅氧烷(PDMS)为原料,通过模具浇注制备芯片主体.以牛皮质骨片为间隔,分隔培养室4个通道进出口采用储液柱封闭.芯片验证实验分为成骨、破骨诱导组和成骨、破骨对照组,成骨、破骨诱导组将小鼠胚胎成骨细胞前体细胞MC3T3-E1和小鼠巨噬细胞RAW264.7分别接种于芯片上,成骨诱导14 d,破骨诱导7 d.成骨、破骨对照组为不进行诱导的MC3T3-E1细胞和RAW264.7细胞.观察指标包括:(1)芯片外观及密封性:芯片制备完成后拍照观察外观并通过密封实验观察密封性能.(2)生物相容性:MC3T3-E1细胞和RAW264.7细胞接种于芯片培养3d及培养1、3、5d后,分别采用钙黄绿素乙酰氧基甲酯/碘化丙啶(AM/PI)染色和细胞增殖及毒性检测试剂盒(CCK-8)实验观察细胞存活情况.(3)成骨分化情况:对成骨诱导组细胞进行碱性磷酸酶(ALP)染色、茜素红染色观察成骨细胞诱导情况.收集成骨诱导组和成骨对照组细胞RNA,qPCR检测成骨细胞标志基因Runt相关转录因子2(RUNX2)、骨钙素(OCN)、Ⅰ型胶原(COL1A1)表达情况,观察成骨细胞分化程度和成骨能力.(4)破骨分化情况:对破骨诱导组细胞进行抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色观察破骨细胞分化情况.提取破骨诱导组和破骨对照组细胞RNA进行破骨分化基因qPCR,检测破骨细胞标志基因TRAP、组织蛋白酶K(CTSK)和树突状细胞特异性跨膜蛋白(DC-STAMP)表达水平.结果 双层含骨基质骨器官芯片大小为3cm×3 cm,整体透光,芯片系统结构对接紧凑,无渗液.钙黄绿素AM/PI染色结果显示,MC3T3-E1细胞和RAW264.7细胞培养3 d后,呈红色荧光死细胞极少.CCK-8实验结果显示,MC3T3-E1细胞和RAW264.7细胞培养5 d内,细胞活力均在90％以上,表明芯片生物相容性好,细胞可以正常存活并增殖.ALP染色和茜素红染色结果显示,成骨诱导14 d,成骨诱导组MC3T3-E1细胞成功分化为成骨细胞并产生钙化结节.qPCR结果显示,成骨诱导组MC3T3-E1细胞的RUNX2相对表达量为4.98±0.74,显著高于对照组的0.99± 0.03(P＜0.01);MC3T3-E1细胞的OCN相对表达量为7.98±0.76,显著高于对照组的1.00±0.06(P＜0.01);MC3T3-E 1细胞的COL1A1相对表达量为7.07±0.56,显著高于对照组的0.97±0.03(P＜0.01).TRAP染色结果显示,破骨诱导7 d,破骨诱导组RAW264.7细胞形成巨大的多核破骨细胞,破骨细胞表达大量TRAP蛋白.qPCR检测结果显示,破骨诱导组RAW264.7细胞的TRAP相对表达量为3.35± 0.37,显著高于对照组的1.01±0.06(P＜0.01);RAW264.7细胞的CTSK相对表达量为3.46±0.79,显著高于对照组的1.01±0.05(P＜0.01);RAW264.7细胞的DC-STAMP相对表达量为1.92±0.12,显著高于对照组的0.98±0.08(P＜0.01).结论 双层含骨基质骨器官芯片结构紧凑,可长期体外培养,生物相容性好,可进行成骨和破骨细胞分化诱导,有望为骨质疏松机制探究和药物筛选提供新的研究平台.
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