查看更多>>摘要:目的 探讨结直肠癌中p53蛋白对Numb蛋白表达的影响及其作用机制,观察两者相互作用对Numb蛋白泛素化降解影响以及对结肠癌细胞凋亡的影响.方法 以人结肠癌细胞系HCT116(+)及HCT116(-)[分别为p53野生型及p53缺失型,美国典型菌种保藏中心(ATCC)来源]作为研究对象,分别采用基因过表达(Transfection)及RNA干扰(RNAi),再用蛋白酶体抑制剂MG132分别处理或不处理细胞12 h,用蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测了 p53蛋白对Numb蛋白表达量及其泛素-蛋白酶体途径稳定性的影响,用流式细胞术检测p53/Numb对结肠癌细胞凋亡的影响.组间比较采用方差分析(ANOVA),独立样本t检验比较蛋白表达量差异,统计学方法分别采用独立样本t检验、独立样本t检验及单因素方差分析.结果 Numb的蛋白水平随着p53的蛋白表达水平的逐渐升高而升高,呈剂量依赖性,空白组与p53转染组(2μg和4 μg)Numb蛋白表达水平比值分别为 0.632(0.633±0.008)和 0.137(0.136±0.003),(t=5.332,P<0.01)而 Numb 的mRNA水平随着p53的mRNA表达水平的升高无明显变化[0.892(0.890±0.003)比0.826(0.825±0.006),t=1.232,P>0.05];p53 RNA干扰或不干扰48 h后,Numb的蛋白水平低于对照组(0.167(0.163±0.001)和 0.536(0.532±0.005),t=3.374,P<0.05),Numb 的 mRNA 水平随着p53的mRNA表达水平的降低无明显变化;同时p53 RNA干扰后,Numb蛋白表达水平降低,而蛋白酶体抑制剂MG132可使Numb的蛋白水平趋于一致[0.753(0.750±0.009)比0.742(0.744± 0.006),t=1.532,P>0.05];当没有MG132时,p53存在情况下的Numb蛋白水平要比p53不存在时的Numb蛋白水平要高,但是此时Numb蛋白水平仍然比MG132存在时的Numb蛋白水平要低;共聚焦显微镜结果示当p53不存在时,Numb主要定位在胞膜及胞质,呈弥散分布;而当有p53存在时,Numb定位于胞质,呈聚集分布并且表达量增多,但p53也有部分是定位在胞质,说明Numb和部分p53共定位于胞质.而在HCT116(p53+)中p53 RNA干扰后作用则与之相反;在HCT116(+)中,转入Numb 48 h后其细胞凋亡数量明显增多(13.7%比48.3%,t=4.523,P<0.01),并与DAPT有同向的协同作用(t=4.523,P<0.01);而在HCT116(-)中细胞凋亡数量也增多,但较前者作用稍弱,而相应空白对照组、空载组变化不明显.结论 结肠癌细胞中p53通过与Numb蛋白的结合通过泛素-蛋白酶体途径影响其蛋白稳定性,通过Numb/Notch通路可能影响结肠癌细胞凋亡.