查看更多>>摘要:[目的]西番莲是一种具有很高经济价值的热带和亚热带水果,但无性繁殖方式导致病毒病成为西番莲产业发展的严重威胁.为了更好地监控田间西番莲病毒病的发生,特开展本研究,以期建立针对西番莲夜来香花叶病毒(telosma mosaic virus,TeMV)、东亚西番莲病毒(East Asian passiflora virus,EAPV)和黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus,CMV)的多重RT-PCR检测方法.[方法]根据已在GenBank上登记的 3 种病毒CP基因的保守序列,分别设计了针对TeMV、EAPV和CMV的 3 对特异性检测引物,通过试验确定了引物浓度、循环数、退火温度等条件,从而获得优化的多重RT-PCR反应体系,并验证了多重RT-PCR的检测灵敏度,然后应用优化体系对广西田间采集的 40 个西番莲叶片样品进行 3 种病毒的检测.[结果]通过优化筛选,在 20 µL的PCR反应体系中实现了西番莲TeMV、EAPV、CMV 3 种病毒的多重检测,最优反应条件是引物体积TeMV和EAPV各 2 µL、CMV3 µL,循环数 35 次,退火温度 54.9℃;验证结果表明,检测灵敏度最高可达 104 拷贝/µL.检测结果表明,3 对特异性检测引物的扩增产物大小分别为 496 bp、279 bp、157 bp.对西番莲叶片样品病毒进行检测的结果表明,TeMV、EAPV和CMV的检测结果分别是 97.5%(39/40),95%(38/40)和 2.5%(1/40),而用单一 RT-PCR 的检测结果分别是 100%(40/40),95%(38/40)和 2.5%(1/40),多重RT-PCR检测结果和单一RT-PCR检测结果的符合度为 99.16%(119/120).同时,TeMV和EAPV倾向于复合侵染,其复合侵染率高达 95%(38/40).[结论]本研究建立了西番莲病毒多重RT-PCR检测的优化体系,能够同时快速、灵敏和可靠地检测TeMV、EAPV和CMV,为这 3 种西番莲病毒田间控制、检疫规划和诊断提供了基础.