查看更多>>摘要:硒蛋白W(selenoprotein W,SELW)是骨骼肌中重要的硒蛋白之一,对细胞分化等多种生物学功能具有重要作用,为探究SELW基因对猪(Sus scrofa)骨骼肌卫星细胞分化的影响.选取3头7日龄健康的大白猪,采集心、肝、脾、肺、肾、背肌、腿肌7个组织样提取RNA,qPCR检测SELW基因在不同组织中的相对表达量.运用在线软件对猪SELW蛋白质进行生物信息学分析.克隆猪SELW基因(GenBank No.NM_213977)CDS全长序列,构建过表达SELW基因重组慢病毒载体并感染骨骼肌卫星细胞,嘌呤霉素筛选获得SELW稳定表达细胞系,通过亚细胞定位确定SELW蛋白的表达部位,qPCR和Western blot检测SELW基因及蛋白的表达水平.收集诱导分化0和48h的细胞样,qPCR检测配对盒子3基因(paired box 3,PAX3)、PAX7、肌源性因子5基因(myogenic factor 5,MYF5)、生肌决定因子基因(myogenic determinant,MYOD)、肌细胞生成素基因(myocyte generating factor,MYOG)的表达量.结果表明,SELW基因在猪7个不同组织中均有表达,在心脏和背肌中表达量极显著高于其他组织(P<0.01).SELW蛋白分子式为C421H677N109O119S3Se1,相对分子质量为9 344.81 D,理论等电点为9.15,属于稳定蛋白质.遗传进化分析可知猪SELW基因与人(Homo sapiens)、恒河猴(Macaca mulatta)、苏门答腊猩猩(Pongo abelii)相似性最高.亚细胞定位结果表明,SELW蛋白定位于细胞核和细胞质.qPCR和Western blot检测SELW过表达效率,SELW-OE组表达量极显著高于SELW-NC组(P<0.01),表明SELW基因稳定表达细胞系构建成功.qPCR结果表明,诱导分化0h时SELW-OE组的PAX7和MYF5基因的表达量极显著上调,而MYOD基因表达量显著下调(P<0.05),MYOG基因的表达量极显著下调(P<0.01);诱导分化48h后PAX3基因的表达量显著上调(P<0.05),PAX7、MYF5、MYOD和MYOG基因的表达极显著上调(P<0.01),表明SELW基因过表达后可促进与骨骼肌细胞分化相关基因的表达.本研究为进一步探讨SELW基因对猪肌肉生长发育的分子调控机制提供基础资料.