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生物工程学报
生物工程学报

杨胜利

月刊

1000-3061

cjb@im.ac.cn

010-64807509

100101

北京朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所B401

生物工程学报/Journal Chinese Journal of BiotechnologyCSCD北大核心CSTPCD
查看更多>>《生物工程学报》是国内外公开发行的全国性学术期刊, 由中国科学院微生物研究所和中国微生物学会共同主办。主要报道生物工程研究的新发展、新成果、新技术。刊登的内容包括：基因工程、细胞工程、酶工程、生化工程、组织工程、生物信息、生物制药、生物芯片等。栏目设有：综述、研究报告、研究简报、技术与方法等。《生物工程学报》创刊于1985年。20多年来，本刊始终以推动生命技术发展和促进国家经济建设为宗旨，及时报道我国生物工程方面的重要研究成果, 有力地促进了国内在这一领域的学术交流，为科研教学和经济建设发挥了积极的作用。本刊已被美国<CA>,<BA>，<MEDLINE>,及<俄罗斯文摘>、中国生物学文摘、中国科学引文数据库、万方数据库、中国科技期刊光盘版等检索系统收录，是中国自然科学核心期刊。
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    B型流感病毒血凝素的表达及免疫原性测定

    杨晨耿小宇原恺张娟琨...
    1112-1123页
    查看更多>>摘要：B型流感病毒是引起季节性流感的原因之一,严重时会造成重大疾病或死亡.为了检测B型流感病毒2个疫苗候选毒株的血凝素(hemagglutinin,HA)蛋白胞外段在哺乳动物细胞中的表达及在小鼠体内的免疫原性,本研究将带有三聚体标签的HA胞外段(HA-ectodomain,HA-ecto)序列及神经氨酸酶(neuraminidase,NA)全长编码框经密码子优化后构建至pCAGGS载体中,通过线性聚乙烯亚胺将pCAGGS-HA-ecto与pCAGGS-NA共转染293T细胞.收集转染后96 h的上清,通过镍离子亲和层析及分子筛层析获得三聚体形式的HA-ecto蛋白,然后将HA-ecto三聚体蛋白免疫小鼠,进行酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)及血凝抑制实验(hemagglutination inhibition,HAI)检测HA-ecto蛋白诱导小鼠后产生的抗体水平.纯化结果显示,通过哺乳动物细胞表达系统能够得到分泌型表达的三聚体HA-ecto蛋白.ELISA及HAI结果显示,三聚体HA-ecto蛋白二次免疫小鼠后,能诱导小鼠产生较高水平的同源和异源交叉抗体.以上结果表明,哺乳动物细胞表达的B型流感病毒HA蛋白可作为亚单位重组流感疫苗的候选.

    B型流感病毒血凝素蛋白哺乳动物细胞表达系统疫苗候选毒株

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    转谷氨酰胺酶2抑制H1亚型流感病毒在MDCK细胞中的增殖

    郭寿清廖月姣仇真毓刘耿...
    1124-1137页
    查看更多>>摘要：组织转谷酰胺酶(transglutaminase 2,TGM2)是一种普遍存在的多功能蛋白,与不同细胞的粘附和肿瘤形成有关.有证据表明,TGM2参与了宿主细胞与病毒间的相互作用,但是对于流感病毒在细胞内增殖的影响还未有报道.为了探究MDCK细胞中TGM2对H1N1亚型流感病毒增殖的影响,本研究构建了TGM2过表达和敲除的MDCK稳定细胞系,感染H1N1亚型流感病毒48h后检测病毒NP和NS1蛋白mRNA和蛋白表达水平的变化,测定病毒滴度.结果显示,过表达TGM2能够有效抑制H1N1亚型流感病毒的NP、NS1基因的表达,而敲除TGM2可上调病毒NP、NS1基因的表达,其中NP蛋白的蛋白表达情况与mRNA水平一致.病毒增殖曲线结果显示,TGM2过表达后H1N1亚型流感病毒滴度显著降低,而敲除TGM2后结果相反,48 h时病毒滴度在敲除细胞中达到高峰,进一步证明TGM2在MDCK细胞中参与对H1N1亚型流感病毒增殖的抑制.通过对流感病毒应答信号途径下游基因的表达分析发现,TGM2可能通过促进激活JAK-STAT分子途径和抑制RIG-1信号途径,抑制H1N1亚型流感病毒增殖.以上发现对于揭示宿主细胞与病毒互作机制以及建立高产的流感疫苗生产基因工程细胞系具有重要意义.

    TGM2MDCK细胞H1N1亚型流感病毒

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    重组靶向核糖体失活蛋白luffin-α-NGR的制备及抗肿瘤活性评价

    周哲越蒋欣怡张宏瑞黄志广...
    1138-1148页
    查看更多>>摘要：将丝瓜籽核糖体失活蛋白luffin-α与肿瘤靶向肽NGR融合,制备luffin-α-NGR重组蛋白,并检测其对肿瘤细胞与血管生成的抑制活性.通过引物设计及PCR扩增获得luffin-α-NGR融合基因,与pGEX-6p-1载体连接后获得pGEX-6p-1/luffin-α-NGR重组质粒,质粒转入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21中表达,以GST亲和层析法分离纯化目的蛋白.MTT比色法、Transwell迁移实验以及鸡胚尿囊膜实验(CAM)检测其活性.结果表明,成功获得全长为 849 bp的luffin-α-NGR融合基因,目标蛋白在16℃、0.5 mmol/L IPTG诱导16 h后获得最佳表达,经SDS-PAGE和Western blotting分析,GST融合蛋白分子量为56.6 kDa,与预期一致.重组蛋白经GST亲和层析、蛋白酶精准酶切去除标签后,利用MTT法验证其对HepG2和MDA-MB-231细胞的抑制效果显著优于luffin-α.Transwell迁移实验和CAM实验证实重组蛋白luffin-α-NGR对肿瘤细胞迁移和血管生成具有明显的抑制作用.本研究成功地制备了重组蛋白luffin-α-NGR,并证实该重组蛋白对肿瘤细胞具有良好的抑制活性,为后续重组靶向蛋白药物的开发奠定基础.

    丝瓜核糖体失活蛋白luffin-α抗肿瘤靶向肽

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    新型镇痛靶点α2δ-1-NMDAR稳定表达细胞株构建及镇痛药物筛选的应用

    董琳张亦雅陈金军
    1149-1158页
    查看更多>>摘要：在多种神经性疼痛动物模型中均发现周围神经损伤可导致由CACNA2D1编码的α2δ-1蛋白在脊髓和背根神经节(DRG)中表达显著上调.CACNA2D1过表达使脊髓背角神经元的突触前和突触后NMDAR活性增强,引起疼痛过敏症.α2δ-1与NMDAR相互作用,促进了 NMDAR在细胞表面转运和突触膜上的定位,可引起神经病理性疼痛,且α2δ-1-NMDAR复合物也被发现存在于其他多种病理状态下,如某些神经源性的高血压、脑缺血.本研究使用慢病毒转染构建稳定表达α2δ-1-NMDAR复合物的人肾胚HEK293T细胞株;通过荧光显微镜、RT-qPCR及Western blotting方法对所建立的稳转细胞系进行鉴定,结果显示HEK293T被成功转染且基因能够稳定表达;并采用膜片钳技术成功建立该细胞株靶向药物筛选体系.该细胞株为进一步研究α2δ-1-NMDAR复合物的相互作用机制及针对慢性疼痛和相关疾病的低副作用的药物筛选提供了良好应用前景的细胞模型.

    α2δ-1NMDA受体α2δ-1-NMDAR复合物神经病理性疼痛靶向药物筛选

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    多囊蛋白2对低频脉冲电磁场促进成骨细胞分化成熟的影响

    何玥颖杨明俊陈卓魏朋...
    1159-1172页
    查看更多>>摘要：已知低频脉冲电磁场(pulsed electromagnetic fields,PEMFs)可以促进体外培养大鼠颅骨成骨细胞(rat calvarial osteoblasts,ROBs)的分化成熟,但ROBs感知PEMFs物理信号并启动成骨性分化的机制至今不明.本研究探究了0.6 mT 50 Hz PEMFs促进ROBs成骨性分化与位于ROBs表面的初级纤毛上的多囊蛋白2(polycystin2,PC2)的关系.首先用免疫荧光染色法研究了PC2是否位于ROBs初级纤毛内,然后通过Western blotting检测了经PEMFs处理不同时间后,ROBs内PC2蛋白表达的变化情况.接着用PC2阻断剂盐酸阿米洛利(amiloride HCl,AMI)预处理ROBs,检测碱性磷酸酶(alkline phosphatase,ALP)活性和PC2蛋白表达受PEMFs处理的影响情况,以及与骨形成相关的Runx-2、Bmp-2、Col-1、Osx的蛋白及基因表达的变化情况.再用RNA干扰法抑制ROBs内PC2的表达后,检测与骨形成相关基因表达情况.结果发现,PC2被定位于ROBs初级纤毛上,PEMFs处理增加了 PC2蛋白表达量.PC2被AMI阻断后,PEMFs不再能提高PC2蛋白表达水平及ALP活性,PEMFs对成骨相关蛋白和基因表达的促进作用也被抵消.使用RNA干扰法抑制PC2的表达后,PEMFs也不再能提高骨形成相关基因的表达.结果表明:存在于成骨细胞初级纤毛表面的PC2在感知并传递PEMFs发出的物理信号中扮演着不可或缺的角色,PEMFs促进ROBs成骨性分化依赖于PC2的存在.本研究为阐明低频脉冲电磁场促进骨形成及治疗骨质疏松的机制研究奠定了基础.

    多囊蛋白2低频脉冲电磁场成骨细胞盐酸阿米洛利RNA干扰

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    Opsin3糖基化位点的鉴定及糖基化修饰功能

    刘中静乔里叶朝阳杨文秀...
    1173-1182页
    查看更多>>摘要：为鉴定Opsin3(OPN3)的糖基化位点,通过使用衣霉素(tunicamycin)以及N-糖酰胺酶F(PNGase F)处理发现OPN3存在糖基化修饰;通过预测以及蛋白质氨基酸位点点突变鉴定OPN3的糖基化位点;利用 SNAP标签蛋白构建了 SNAP-Opsin3(SNAP-OPN3)重组蛋白,使用SNAP-OPN3重组蛋白进行糖基化修饰对OPN3功能影响的研究.在表达SNAP-OPN3重组蛋白后,使用SNAP-tag的反应底物SNAP-Surface? 549以及SNAP-Cell? Oregon Green?通过荧光共聚焦显微镜观察OPN3以及OPN3糖基化位点突变体是否能够成熟转运至细胞膜.结果表明,OPN3的N82位点为OPN3的糖基化位点;SNAP标签不影响OPN3功能的正常发挥;使用SNAP反应底物可以清楚地观察到糖基化位点突变的OPN3不能正常转运至细胞膜.本研究首次鉴定了OPN3的糖基化位点,并构建了SNAP-OPN3重组蛋白,发现SNAP标签并不影响OPN3的成熟转运,并利用SNAP底物验证了糖基化修饰影响OPN3蛋白的成熟转运.

    Opsin3糖基化修饰SNAP蛋白成熟

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    人脐带和胎盘不同层次间充质干细胞的生物学特性分析

    易笑刘凡陈枫王沂峰...
    1183-1196页
    查看更多>>摘要：间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)在再生医学中具有广阔的应用前景,其临床转化应用已成为研究热点,如何大量获取原代间充质干细胞以及针对不同疾病选择最为合适的细胞来源是关键.为了探讨不同来源间充质干细胞的异同,为临床治疗与研究选择合适的种子细胞提供参考,文中比较了人脐带和胎盘不同层次间充质干细胞(MSC)的生物学特性,包括细胞形态、表面标志物、分化能力及核型分析,并对4种胎儿来源的MSCs进行了转录组序列分析,针对转录组测序结果,从增殖能力和分泌细胞因子等方面对不同来源的MSCs进行了分析验证.结果显示,脐带(umbilical cord,UC)、羊膜(amniotic membrane,AM)、绒毛膜平滑肌层(chorionic membrane,CM)、绒毛膜滋养层(chorionic villi,CV)和蜕膜(deciduae,DC)等5种不同来源的MSCs均符合2006年国际细胞治疗协会(international society for cell therapy,ISCT)的最低标准,符合干细胞的一般特性;核型分析表明除了DC来源MSCs来自母体,UC、AM、CM、CV来源MSCs均来自胎儿;转录组测序分析结果显示,来自脐带和胎盘的MSCs具有相似的基因表达模式,但也存在一些差异,这些特定基因涉及细胞周期、细胞分裂、细胞死亡、细胞生长和发育.这些基因还在转录调节、DNA修复、DNA复制和染色体稳定性中起作用,这是细胞或亚细胞组分运动、细胞通信、细胞组织突起、细胞因子分泌和激素代谢的重要组成部分.转录组测序分析的结果在一定程度上解释了不同来源的MSCs之间生物学特征的差异;基于测序结果的验证实验可知,不同来源的MSCs在增殖能力和细胞因子分泌能力存在显著差异.总的来说,UC-MSCs和CV-MSCs表现出更强的增殖能力,分泌更高水平的旁分泌因子,可能在未来疾病的治疗中有不同的优势.

    胎盘脐带间充质干细胞干细胞生物学特性核型分析

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    基于胶体金的8-羟基-2'-脱氧鸟苷免疫层析试纸条

    叶伟伟王丽文张宇李潮锋...
    1197-1208页
    查看更多>>摘要：8-羟基-2'-脱氧鸟苷(8-hydroxy-2'-deoxyguanosine,8-OHdG)是评价DNA氧化损伤较灵敏和稳定的生物标志物.文中采用竞争法建立一种快速、灵敏检测8-OHdG的胶体金免疫层析试纸条.将样品垫(玻璃纤维素膜)、结合垫(玻璃纤维素膜)、硝酸纤维素膜和吸水垫依此粘贴在聚氯乙烯(polyvinyl chloride,PVC)底板上,构建试纸条.通过柠檬酸钠还原三水合四氯金酸制备胶体金(gold nanoparticles,AuNPs),8-OHdG 配对的抗体(antibody,Ab)包被于 AuNPs 的外层(Ab coated AuNPs,Ab@AuNPs)作为探针.牛血清蛋白(bovine serum protein,BSA)与8-OHdG用碳二亚胺盐酸盐偶联制备人工抗原,作为检测线的包被抗原.羊抗鼠多抗(imunoglobulin G,IgG)作为质控线的包被抗体.对试纸条的硝酸纤维素膜、上样液的配方、金标抗体喷涂量等实验参数进行了优化.结果表明,硝酸纤维素膜(nitrocellulose film,NC)膜采用CN95,上样液的最优配方为1％BSA+3％吐温-20+3％蔗糖+0.9％NaCl溶液,最适金标抗体喷涂量为4 μL.利用试纸条在可见光下检测8-OHdG,根据检测线(test line,T线)和质控线(control line,C线)的显色强度对比,可初步判断尿液中8-OHdG的含量水平.并通过T线的灰度值计算尿液中的8-OHdG的浓度,检测限为2.55μg/L.该方法简单、快速且有较好的特异性,可检测人体尿液中的8-OHdG含量,以初步评价人体的健康状态.

    免疫层析胶体金8-羟基-2'-脱氧鸟苷试纸

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    超滤-高效液相色谱法检测pHLA复合物中的抗原肽

    应婷程巧珍陈春廖学俊...
    1209-1217页
    查看更多>>摘要：重组HLA-Ⅰ类分子/抗原肽复合物(pHLA复合物)在研究人类T细胞特异性免疫应答中有重要用途.pHLA复合物的制备以基因工程及蛋白体外稀释折叠复性技术为基础,在体外复性体系中重组HLA-Ⅰ类分子正确折叠,并结合抗原肽形成复合物.本研究建立了一种超滤-高效液相色谱法(超滤-HPLC法)定量检测重组pHLA复合物中的抗原肽,尤其针对少量制备产物中抗原肽的检测.通过将重组HLA-Ⅰ类分子和抗原肽加入到复性缓冲液中,使重组HLA-Ⅰ类分子的重链(heavy chain,HC)与轻链(β2m)复性折叠,与含锚定残基的VYF抗原肽结合形成pHLA复合物,经超滤去除未结合的游离抗原肽VYF而保留复合物,最后将pHLA复合物经酸处理破坏其相互作用从而释放抗原肽,再超滤收集VYF抗原肽并进行HPLC检测,所测得的VYF抗原肽即为重组HLA-Ⅰ类分子与抗原肽相互作用所结合的抗原肽.结果显示,制备的重组pHLA复合物可被HLA-Ⅰ分子构象特异性抗体W6/32识别,这说明重组HLA-Ⅰ类分子折叠构象正确,可鉴定为pHLA复合物;而超滤-HPLC法也可检测到pHLA复合物中含有抗原肽VYF,因此将超滤-HPLC法用于检测pHLA复合物的方法可行.与Western blotting法相比,超滤-HPLC法定量检测抗原肽浓度范围为0-9 μg/mL,可根据复合物中结合的抗原肽量来优化不同结合条件,以提高HLA-Ⅰ类分子折叠效率并促进HLA-Ⅰ类分子结合抗原肽,还可根据pHLA复合物结合的抗原肽含量计算复性体系中形成pHLA复合物的制备率.因此文中所建立的超滤-HPLC法可用于pHLA复合物制备过程的质量控制,在T细胞特异性免疫研究、人工抗原呈递细胞以及特异性四聚体探针应用开发方面都具有优势.

    超滤高效液相色谱重组HLA-Ⅰ类分子抗原肽折叠复性

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    多片段扩增结合Gibson组装法克隆基因定点突变

    程盈盈李国庆刘君怡陈婉煜...
    1218-1226页
    查看更多>>摘要：为寻找一种简洁高效的基因定点突变方案,利用Gibson组装技术对重叠延伸PCR法进行简化,并以克隆细胞周期蛋白依赖性激酶4基因单位点与双位点突变为例进行验证.采用与重叠延伸PCR相似的策略扩增含点突变的基因片段,同时采用双酶切制备线性质粒载体,保证质粒载体与基因片段含有一小段重叠序列作为接头.直接将基因片段与线性载体通过Gibson组装法拼接成完整质粒.经转化、筛选与检测,成功得到数个单位点与双位点目标突变体克隆,且阳性率均为100％.由于没有繁琐的多轮PCR扩增和频繁的DNA回收操作,也无需消化原始质粒,该方案避免了很多干扰定点突变的因素,能简便、高效地克隆基因单位点与多位点突变.对比而言,该方案规避了重叠延伸PCR与滚环扩增法的主要缺陷,是一种基因定点突变的良好解决方案.

    定点突变重叠延伸PCR滚环扩增Gibson组装细胞周期蛋白依赖性激酶4

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